Кашкин В.А Различия в поведении мышей двух линий С57Вl/6 и BALB/c в тесте открытого поля на фоне введения прегабалина . Лабораторные животные для научных исследований. 2020; 4. https://doi.org/10.29296/2618723X-2020-04-09
Цель исследования – оценка поведения мышей – 2 линий С57Вl/6 и BALB/c в тесте открытого поля, а также влияния препарата с доказанной анксиолитической активностью Лирика® (МНН: прегабалин) в условиях теста. В эксперименте использовали 20 самцов мышей линии С57Вl/6 и 20 самцов мышей BALB/c массой тела 20–25 г. Прегабалин вводили в течение 14 дней в дозе 10 мг/кг внутрижелудочно в виде предварительно приготовленной суспензии в 1% растворе крахмала. Контрольные животные получали носитель в объеме, соответствующем объему введенного препарата. Тест открытого поля проводили на 14-й день введения (через 1 ч после применения прегабалина и контрольного вещества), длительность тестирования для каждого животного составила 5 мин. Ориентировочно-исследовательскую активность животных оценивали по ряду элементарных двигательных актов и поз, совокупность которых характеризует целостное поведение при тестировании в установке «открытое поле». Оценены следующие показатели: количество пересеченных квадратов на периферии, заходов в центральный квадрат, число пристеночных и свободных стоек, заглядываний в норки, количество меток уринаций и болюсов. Анализ полученных результатов показал, что у мышей линии C57Bl/6 с преобладанием активного типа поведения препарат «Лирика®» (МНН: прегабалин) при 14-дневном введении оказывает слабое анксиолитическое действие. Напротив, у мышей линии BALB/c с преобладанием пассивного типа поведения курсовое введение прегабалина давало выраженный противотревожный эффект, который характеризовался усилением локомоторной активности и исследовательской активности в тесте открытого поля. Полученные на двух различных по поведенческому фенотипу (реакция на стресс) линиях мышей результаты могут способствовать выявлению генетических и биологических основ стратегий преодоления стресса у людей. В перспективе такие данные дают возможность более персонализировано подходить к терапии невротических синдромов у пациентов с депрессивноподобным поведением.
Экспериментальные тесты для определения уровня тревожности моделируют конфликтные ситуации, в которых определенная мотивация принуждает животное продемонстрировать опасное с биологической точки зрения поведение. Тест открытого поля – один из самых распространенных инструментов, используемых в психофармакологии для изучения влияния веществ на ориентировочно-исследовательское поведение, двигательную активность и для выявления анксиолитического действия лекарственных кандидатов [1]. Однако без учета характера эмоционально-стрессовой реакции животных в условиях этого теста анксиолитическое действие может отчетливо не выявляться [2]. В противоположность этому оценка противотревожных веществ с использованием фармакогенетического подхода позволяет выявить специфический анксиолитический эффект препарата на разных линиях мышей в зависимости от типа их эмоционально-стрессовой реакции [3]. Так, у мышей линии С57Вl/6J обычно отмечается активный тип реакции на эмоционально-стрессовое воздействие, а линии BALB/c, наоборот, пассивный тип поведения. Анксиолитики оказывают отчетливое действие у животных с пассивным типом поведения, которое выражается в устранении состояния замирания (freezing), страха и в активации поведения. В противоположность этому у мышей с активным типом поведения (С57Вl/6J) транквилизаторы вызывают седативный эффект [4].
Цель исследования – оценка влияния препарата с доказанной анксиолитической активностью Лирика® (МНН: прегабалин) на поведение мышей линии С57Вl/6 и BALB/c в тесте открытого поля. Прегабалин является высокоаффинным модулятором потенциально-зависимых кальциевых каналов α2δ-типа [5], препарат продемонстрировал противотревожное действие на моделях конфликтной ситуации Геллера–Сейфтера, в приподнятом крестообразном лабиринте [6] и на экспериментальной модели посттравматического стресса [7].
Препараты
Препарат Лирика® (МНН: прегабалин) (Pfaizer Inc, США) вводили животным внутрижелудочно в течение 14 дней в дозе 10 мг/кг в виде приготовленной непосредственно перед введением суспензии в 1% растворе крахмала. Контрольные животные получали 1% раствор крахмала в объеме, соответствующем объему введенного препарата – 1 мл/кг.
Животные и условия их содержания
В эксперименте использовали самцов мышей линии С57Вl/6 (n=20) и BALB/c (n=20) массой тела 20–25 г (питомник АО НПО «Дом Фармации», Россия). Животных содержали группами по 10 особей в клетке в стандартных условиях: фоторежим 12 ч свет/12 ч темнота, температура воздуха 19–25°С, влажность 50 ± 20% при свободном доступе к очищенной воде (Aquaphor®, Санкт-Петербург, Россия) и стандартному корму (ПК-120-1, приготовленный по ГОСТу Р50258-92). Научно-исследовательская работа выполнена в соответствии с рекомендациями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. По завершении эксперимента животных подвергли эвтаназии, используя СО2.
Тест открытого поля
Экспериментальная установка
Установка «открытое поле» состояла из камеры размером 40×40×20 см с прозрачной крышкой. Пол камеры был равномерно разделен линиями на 9 квадратов с 4 отверстиями (норками) диаметром 2 см.
Экспериментальная процедура
Прегабалин вводили внутрижелудочно, однократно в течение 14 дней, за 1 ч до проведения теста.
Тестирование выполняли при обычном освещении с интенсивностью светового потока в 300 лк. Эксперимент начинали с помещения животного на один из периферийных квадратов открытого поля. Длительность теста 5 мин. По истечении времени наблюдения животное извлекали из установки и помещали в домашнюю клетку.
Оценивали количество:
Статистический анализ данных
Обработку полученных данных проводили с помощью пакета статистических программ SAS (SAS v.9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, США). Парное сравнение осуществляли с использованием t-теста (в случае нормально распределенных данных) и теста Манна–Уитни (в случае если распределение данных не соответствовало нормальному). Различия считали значимыми при р<0,05.
Оценка поведенческих реакций мышей линии C57Bl/6 в тесте открытого поля
На 14-й день введения прегабалина проведена оценка поведения мышей линии C57Bl/6 в тесте открытого поля, по результатам которой не установлено влияние препарата на такие показатели поведенческой активности животных, как количество пересеченных квадратов и заглядываний в норки (р>0,05; t-тест, табл. 1), при этом обнаружено значимое снижение количества пристеночных стоек (p<0,05; тест Манна–Уитни, табл. 2) по сравнению с показателями в контрольной группе.
Оценка поведенческих реакций в тесте открытого поля мышей линии BALB/c
Оценка поведения мышей линии BALB/c после 14-дневного введения прегабалина в тесте открытого поля выявила значимое увеличение количества пересеченных квадратов (p=0,001; t-тест, табл. 3) и заходов в центральный квадрат (p<0,05; тест Манна–Уитни, табл. 4) экспериментальных животных по сравнению с показателями в контрольной группе.
Таким образом, по результатам тестирования 14-дневное введение препарата Лирика® (МНН: прегабалин) мышам линии C57Bl/6 с преобладанием активного типа поведения оказало слабое анксиолитическое действие, которое имело седативный характер у данной линии мышей. Напротив, у мышей линии BALB/c с превалированием пассивного типа поведения после курсового (в течение 14 дней) введения наблюдалось выраженное противотревожное действие прегабалина, которое характеризовалось усилением активного поведения и исследовательской активности в тесте открытого поля.
Выбор линии животных, используемых в исследованиях по изучению тревожности, является важным этапом экспериментального планирования. Хорошо известно, что результаты поведенческих экспериментов могут сильно различаться не только в зависимости от условий проведения тестирования, но также и в зависимости от используемой линии лабораторных животных [8, 9]. Так, особенностью мышей С57Bl/6J по сравнению с мышами других линий является пониженный уровень тревожности [4, 10, 11]. Напротив, было показано, что мыши линии BALB/c показывают более выраженную поведенческую реакцию в ответ на эмоциональный стресс, чем линии C57Bl/6 [12]. Поэтому фармакологические эффекты даже «классических» анксиолитиков могут довольно сильно различаться при их тестировании на различных линиях мышей. Например, введение неселективного бензодиазепина хлордиазепоксида не вызывало анксиолитического действия у мышей линии С57Bl/6 в О-образном лабиринте [13] и тесте открытого поля [14]. Однако введение пикротоксина, блокатора хлорных каналов, связанных с ГАМК-А рецепторами, привело к возникновению анксиогенного эффекта [14]. Причины получения различных результатов в данных поведенческих тестах, вероятно, обусловлены межлинейной вариабельностью функциональной активности нейротрансмиттерных систем.
Показано, что фенотипические различия в поведении коррелируют с уровнем активации норадренергической системы в гипоталамусе [15]. Так, уровень норадренергической активности у мышей C57Bl/6 выше, чем у пассивных животных линии BALB/c. Эмоциональный стресс, который испытывают животные в тесте открытого поля, приводит к уменьшению активности норадренергической системы в гипоталамусе у мышей обеих линий (BALB/c и C57Bl/6). Однако наряду с этим у мышей C57Bl/6 с активным типом поведения в тесте открытого поля в гипоталамусе снижен уровень серотонина и его метаболита 5-HIAA в отличие от мышей с реакцией замирания (пассивные мыши линии BALB/c), у которых наблюдается увеличение содержания ГАМК после реакции эмоционального стресса. Также у активных мышей в стриатуме (полосатое тело) головного мозга повышено соотношение DOPA/DA, что указывает на усиление использования дофамина у высокоактивных животных. Напротив, у мышей линии BALB/c не наблюдается изменений уровня дофамина в структурах головного мозга, что может быть истолковано как отсутствие вовлеченности или даже снижение активности дофаминергической системы [16].
Таким образом, эмоциональный стресс, вызванный проведением теста открытого поля, у мышей различных фенотипов связан с изменениями функциональной активности нескольких нейротрансмиттерных систем (ГАМКергических, дофаминергический, серотонинергической и др.) [17].
В проведенном исследовании слабое проявление противотревожных свойств препарата прегабалин (Лирика®) у линии мышей с активным типом поведения (линия C57Bl/6) обусловлено фармакологическим профилем прегабалина. Прегабалин является блокатором альфа-2/дельта-1 Q/R-подтипа кальциевых каналов и, помимо прочего, уменьшает выход возбуждающей аминокислоты глутамата в различных структурах головного мозга [18, 19]. Из работы S.B. Seredenina [20] известно, что у животных с выраженной реакцией страха на воздействие эмоционального стресса (линия BALB/c), вызванного тестом открытого поля, происходит снижение содержания глутамата в стриатуме, тогда как у активных животных (линия C57Bl/6) уровень глутамата повышается [15]. Поэтому введение прегабалина, возможно, уменьшает повышенный уровень возбуждающей аминокислоты глутамата, что приводит большинство показателей мышей с активным поведением к физиологическим нормам интактных животных.
Все это говорит о большой вариабельности получаемых данных в тесте открытого поля. Результаты зависят от множества причин, среди которых не только конкретная линия мышей, но также сток и питомник, из которого получены животные. Влияние на результаты поведенческих экспериментов могут оказывать такие факторы, как материал, из которого изготовлена установка «открытое поле», освещение (крайне важно!), ольфакторные сигналы, обстановочные стимулы помещения, где проводят тестирование и др. Из этого следует, что данные, полученные в разных лабораториях, могут сильно варьировать в зависимости от сочетания всех вышеупомянутых факторов. Ранее был дан пример того, что даже «классические» транквилизаторы могут не оказывать влияние на поведение животных в тесте открытого поля.
Изменение уровня вертикальной активности может рассматриваться как маркер анксиолитической или анксиогенной активности препаратов в тесте открытого поля. Напротив, широкоиспользуемый маркер анксиолитической активности (продолжительность нахождения в центральных квадратах) нечувствителен к действию «классических» транквилизаторов, которые при этом могут снижать вертикальную активность (rearing), что ряд авторов интерпретируют как анксиолитическая активность [21]. Именно поэтому полученные результаты в плане эффективности прегабалина были оценены как слабо выраженные, т.е. не исключающие наличия у данного препарата противотревожного действия.
Немаловажным становится и тот факт, что полученные на двух различных по поведенческому фенотипу (реакция на стресс) линиях мышей результаты могут также способствовать выявлению генетических и биологических основ стратегий преодоления стресса у людей, в том числе так называемые ориентированные на проблемы и эмоции [22]. В перспективе такие данные могут помочь более персонализировано подходить к терапии невротических синдромов у пациентов с депрессивноподобным поведением.
Таким образом, в результате настоящего исследования был подтвержден факт того, что проведение тестирования анксиолитической активности лекарственных кандидатов должно учитывать поведенческий фенотип, характерный для определенной линии животных.