Новое в науке и практике доклинических исследований

Новое в методах выполнения процедур

В статье Journal of the American Association for Laboratory Animal Science за ноябрь 2019 г., посвященной сравнительному анализу гематологических и бактериологических показателей крови, взятой из десневой вены и полой вены у морских свинок, приводятся преимущества и недостатки указанных методов [1]. Авторы указывают, что методы сбора крови у морских свинок по сравнению с другими грызунами ограничены из-за их короткой шеи и конечностей, а также отсутствия хвоста. В связи с указанным они предлагают новый метод забора крови для морских свинок — десневую венопункцию, при которой используется десневая вена, расположенная в десне чуть ниже пары нижнечелюстных резцов.

В эксперименте применяли морских свинок Dunkin Hartley. Для отбора крови десну промывали либо только стерильным физиологическим раствором, либо стерильным физиологическим раствором с последующей обработкой разведенным раствором хлоргексидина. Далее вводили инсулиновый шприц каудально примерно на 3-5 мм вглубь десны непосредственно под нижними резцами. При этом исследователи отбирали не менее 250 мкл крови для гематологического анализа и не менее 200 мкл для бактериологического 1 раз в неделю в течение 6 нед. Контролем служили морские свинки, у которых кровь забирали из полой вены после предварительной дезинфекции кожи в месте отбора проб с использованием хлоргексидина и спирта.

В результате проведенных исследований показано, что десневая венопункция является менее травматичным методом отбора крови, чем процедура, проводимая из полой вены. При этом достоверных различий в показателях полного гематологического анализа крови не выявлено за весь изучавшийся период. Однако в бактериологическом анализе обнаружен рост количества бактерий во всех 5 образцах крови из десневых вен, обработанных только физиологическим раствором, и в 2 из 5 образцов, обработанных разбавленным хлоргексидином, в то время как количество бактерий не росло ни в одном образце крови из полой вены. Таким образом, результаты настоящего исследования свидетельствуют, что десневая венопункция может использоваться в качестве альтернативного минимально травматичного метода отбора крови у морских свинок для гематологического анализа крови, но не подходит для посева крови с последующей бактериологической оценкой.

Другие исследователи [2] впервые провели сравнительный анализ 6 наиболее часто используемых в настоящее время методов отбора крови у мышей (боковой разрез хвоста; ампутация кончика хвоста; пункция подъязычной, поднижнечелюстной и подкожной вен; пункция ретробульбарного синуса при анестезии изофлураном). И хотя, как заключают авторы, ни один из методов существенно не превосходил другие как по влиянию на общее состояние, так и по иммунологическим и гистопатологическим показателям, все же имелись некоторые различия между ними. Так, например, на 2-й день после отбора крови наибольшее снижение массы тела отмечалось при использовании метода ампутации кончика хвоста, наименьшее — при взятии крови из хвостовой вены (р = 0,010). На 10-е сутки мыши из группы пункции ретробульбарного синуса потеряли значительно больше массы тела по сравнению с группами пункции подкожных (р = 0,008) и подчелюстных (р = 0,024) вен. Одновременно группа мышей, у которых кровь отбирали сублингвально, потеряли значительно (р = 0,020) больше массы тела, чем группа отбора крови путем пункции подкожных вен.

Кроме различий во влиянии на массу тела, отмечались отличия и в результатах гистопатологического исследования (табл. 1). Как видно из табл. 1, наиболее существенные различия между группами животных регистрировались в отношении длительности острого воспаления, которая была минимальной при отборе крови с помощью подъязычной пункции и пункции ретробульбарного синуса, а максимальной  при ампутации кончика хвоста. В последнем случае отмечалось также неполное заживление места забора крови. Отбор крови с помощью подъязычной пункции сопровождался развитием микроабсцессов со 2-го по 8-й день после процедуры, при других методах этого не наблюдалось.

Следует отметить некоторые различия и в уровне кортикостерона: при венепункции из области головы уровень кортикостерона крови был выше, чем при отборе крови из хвостовой вены. Из 6 исследованных методов взятия проб крови наиболее неблагоприятное влияние на животных оказали ретробульбарная синусовая пункция и сублингвальная пункция, использование которых без анестезии вызывает выраженный стресс у животных. В заключение авторы отмечают, что совершенно безвредных процедур отбора крови нет, поэтому в каждом случае необходимо руководствоваться принципом минимизации повреждений в организме и влияния на полученные данные при проведении конкретного исследования в зависимости от длительности эксперимента, количества отборов крови в динамике (одноразовый или многократный) и др.

Новое в уходе за лабораторными животными

В статье K.A. Bartley и C.H. Johnson [3] рассматривается вопрос о возможности и эффективности применения ползунков новорожденных для послеоперационной защиты заживающих ран у новозеландских белых кроликов, наиболее часто используемых в биомедицинских исследованиях. При этом авторы отмечают, что обычно для защиты заживающих ран у экспериментальных животных применяются «Елизаветинские» воротники (у нас — воротник пластиковый защитный), которые ограничивают проявление типичных форм поведения, в том числе копрофагии, ухода за собой и социального поведения. Кроме того, защитные воротники часто спадают у кроликов, когда они трутся о клетку, что вызывает травмирование области операционного разреза и необходимость дополнительного лечения, увеличивая сроки выздоровления и искажая результаты исследования.

Авторы проанализировали результаты наблюдения за 154 интактными самцами новозеландских белых кроликов (возраст от 2 до 3 мес) после проведенной бедренной ангиопластики. Кролики были распределены на 2 группы: в 1-й группе (72 животных) использовали воротник пластиковый защитный, во 2-й группе (82 животных) — ползунки. При этом оценивали социальное поведение, затраты на обеспечение послеоперационного ухода, частоту послеоперационных осложнений, сроки выздоровления.

Для животных 1-й группы использовали защитные воротники из полиэтилена низкой плотности, они имели диаметр от 28 до 38 см (рис. 1). Во 2-й группе применяли ползунки для младенцев от 0 до 3 мес из 100% хлопка с полностью эластичным поясом (рис. 2), разработанные для детей массой тела 5-7 кг и длиной 60-63 см. В ползунках прорезали щель длиной 5-7 см для размещения гениталий и хвоста, что позволяло животному свободно мочиться и испражняться внутри клетки. И воротники, и ползунки надевали на кроликов сразу после операции, во время восстановления после наркоза сроком на 10 дней, что достаточно для заживления раны. В течение 10-дневного послеоперационного восстановительного периода на кроликах были и пластиковый воротник, и детские ползунки.

Исследования показали, что использование ползунков для послеоперационной защиты у кроликов было более успешно, чем воротников, как в отношении обеспечения адекватного социального поведения, так и в плане скорости заживления, меньшей травматизации места операционного разреза, при этом существенно уменьшались затраты на дальнейший послеоперационный уход.

X. Wang и соавт. [4] исследовали новую систему содержания лабораторных животных, получившую название «индивидуально вентилируемые клетки» (ИВК), широко используемые в настоящее время. Системы ИВК обладают многочисленными преимуществами, включая относительно низкие затраты, простоту эксплуатации и высокую степень изоляции, что позволяет защитить животных от воздействия внешней среды (инфекций, аллергенов и др.), а персонал от выделений животных в воздух вивариев. По сравнению с непроветриваемыми клетками в ИВК более низкий уровень аммиака, СО₂ и меньшая влажность на фоне большего содержания кислорода. Постоянная вентиляция клеток уменьшает накопление вредных газов, обеспечивает сушку подстилки, а также позволяет снизить у животных стрессовые реакции, физиологические и гормональные нарушения, ослабляющие здоровье животных.

Важным техническим показателем систем ИВК является режим вентиляции, определяемый как кратность воздухообмена (КВО) за один час, который существенно влияет на микросреду клетки и здоровье лабораторных животных. Авторы исследовали режимы вентиляции с частотой обмена воздуха 40, 60 и 80 раз в час. В каждой клетке содержалось по 5 мышей, а внутри каждой стойки было по 6 клеток. Эксперимент длился 3 нед. При этом оценивали как состояние воздушной среды в клетках, так и показатели здоровья животных. Изучаемые параметры окружающей среды включали суточные уровни аммиака, а также температуру и относительную влажность воздуха в клетках и помещении. Для оценки состояния здоровья мышей регистрировали массу тела, уровень гормонов стресса (кортикостерон, гормон роста и адреналин), Т-лимфоцитов (CD4 и CD8), содержание иммуноглобулинов (IgG, IgM и IgA) и иммунных клеткок. Кроме того, в качестве контроля использовали две клетки с открытым верхом, находившиеся в этом же помещении, в которых содержалось по 5 животных в каждой.

Проведенные исследования показали, что КВО, равная 40, не обеспечивает поддержание здоровой воздушной среды в клетке и в ближайшем окружении. При КВО 80 высокая скорость обмена воздуха вызывала дискомфорт у мышей и отрицательно влияла на физиологические показатели состояния организма. Оптимальной по воздействию  и на воздушную среду, и на показатели здоровья животных оказалась КВО 60 раз в час. Показатели контрольной группы были наиболее близки с группой, где КВО равнялась 60.

Новое в моделировании исследований на животных

В статье журнала Comparative Medicine за октябрь 2019 г. [5], посвященной диетиндуцированному генерализованному пародонтиту у крыс линии Льюис, авторы на основании анализа литературы разработали оптимальную модель пародонтита у грызунов, экспериментальную оценку которой они и приводят в данной публикации. Так, в статье предлагаются не только конкретный рацион питания для индуцирования пародонтита, но и конкретные методы оценки его эффективности, а также методология эксперимента. При этом исследователи использовали модифицированный синтетический рацион питания AIN93G (Purina TestDiet, St Louis, MO), обогатив его сахарозой (70% от общей энергоценности рациона) и казеином (18%) — СК-рацион. Этот рацион вызывал нарушение микрофлоры полости рта, что способствовало развитию воспаления и пародонтита без механического вмешательства. Контрольные животные находились на стандартном для крыс синтетическом рационе питания.

Для исследования были взяты крысы линии Льюис 5-недельного возраста, которых разделили на 3 группы: 1-я и 2-я группы получали стандартный рацион питания, а 3-я находилась на СК-рационе. При этом животные 1-й группы служили исходным контролем и подверглись эвтаназии через неделю нахождения на стандартном рационе, а животные 2-й и 3-й групп получали соответствующие рационы питания в течение 24 нед.

При оценке состояния животных и развития признаков пародонтита проводили гистологические и гистохимические исследования тканей пародонта, анализ экспрессии генов воспалительных цитокинов, денситометрию костной ткани, определяли концентрации лептина и инсулина в сыворотке крови и ряд других показателей состояния пародонта и организма в целом. Для итоговой оценки пародонтита использовали 5-балльную систему: отсутствие нарушений, незначительный, легкий, умеренный и тяжелый пародонтит. В результате применения указанной модели исследователям удалось добиться развития у подопытных животных пародонтита легкой (гиперплазия и воспаление десен, накопление зубного (бактериального) налета) и умеренной (эрозии, язвы и гиперплазия десен, выраженное накопление бактериального налета, разрушение периодонтальной связки, умеренная резорбция альвеолярной кости) степени тяжести.

Таким образом, авторы делают вывод, что предлагаемая модель (крысы) является перспективной для моделирования пародонтита легкой и средней степени тяжести, близкого по своей форме таковому у человека.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов

Макарова М.Н. – идея, работа с источниками литературы, написание, редактирование текста.

Макаров В.Г. – сбор и систематизация данных, написание отдельных фрагментов текста.