Бактериальные инфекции легких. Модели на животных

Введение

Пневмония — это не отдельное заболевание, а группа специфических инфекций, каждая из которых имеет разную эпидемиологию, патогенез и клиническое течение [1].

В группе риска находятся дети и пожилые люди. Большинство людей, которые переболели пневмонией легких, подвержены осложнениям, связанным со снижением когнитивных функций, депрессиями, сердечно-сосудистым заболеваниям и уменьшением продолжительности жизни [2]. Несмотря на применение эффективных антибиотиков и интенсивной терапии, смертность, связанная с пневмонией, существенно не снизилась с 1960-х годов [3].

Во всем мире пневмония является основной причиной детской смертности, особенно среди детей в возрасте до 5 лет [4]. У детей бактериальная пневмония чаще всего вызывается такими микроорганизмами, как Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae типа b (Hib). На первом месте в числе возбудителей пневмонии стоит Streptococcus pneumoniae, тогда как вторым по значимости возбудителем является Haemophilus influenzae типа b (Hib) [5].

Повышенный риск у пожилых людей, вероятно, обусловлен нарушением защитных функций организма и имеющейся сопутствующей патологией (сердечная недостаточность, заболевания печени и основные заболевания легких), увеличивающими риск аспирационной пневмонии, которая может возникать из-за дисфагии и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни [6].

Среди внутрибольничных заболеваний пневмония стоит на 1-м месте по числу смертей. Большому риску подвержены пациенты, находящиеся в отделении интенсивной терапии [7]. Основными возбудителями госпитальной пневмонии при искусственной вентиляции легких (ИВЛ) чаще всего являлись Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Acinetobacter baumannii. Однако последние данные показывают, что бактерии семейства Enterobacteriaceae, в частности Escherichia coli, в настоящее время являются частыми возбудителями госпитальной пневмонии при ИВЛ [8].

На данный момент в мире стоит острая необходимость в более совершенных методах лечения и профилактики заболевания, требуются новые знания о патогенезе пневмонии. Фармакологические модели с использованием лабораторных животных необходимы для лучшего понимания механизмов, лежащих в основе появления устойчивых штаммов и расшифровки взаимодействия хозяина и патогена, особенно когда речь идет о полимикробной инвазии, при исследовании новых методов лечения и осложнений, которые вызывает пневмония.

Данный обзор посвящен описанию наиболее часто используемых моделей животных при изучении бактериальной пневмонии, обобщены данные научных исследований бактериальной пневмонии смоделированной на грызунах, кроликах, свиньях и приматах.

Бактериальные штаммы

Streptococcus pneumoniae — грамположительная бактерия — внеклеточный, условно-патогенный микроорганизм, который колонизирует поверхность слизистой оболочки человека. Около 27–65% детей и 10% взрослых являются носителями S. pneumoniae [9]. Бактерия приводит к развитию таких заболеваний, как пневмония, локальные инфекции среднего уха, гнойный менингит, и способна активно проникать в кровоток, вызывая бактериемию и сепсис [10].

Legionella pneumophila — грамотрицательная внутриклеточная бактерия — распространенный патоген, вызывающий больничные и внебольничные пневмонии. Это один из наиболее распространенных возбудителей тяжелой пневмонии, уровень смертности 10% в Европе и Северной Америке [11]. На данный момент сообщается только об одном случае передачи L. pneumophila от человека к человеку [12], подавляющее большинство случаев связано с заражением воздушно-капельным путем из-за загрязненной воды. Зараженная вода распределяется в виде водно-воздушного аэрозоля системами кондиционирования воздуха [13].

Haemophilus influenza представляет собой грамотрицательные коккобациллы, встречаются инкапсулированные и неинкапсулированные штаммы (нетипируемые H. influenzae, NTHi). NTHi является опасным патогеном, который вызывает у детей средний отит, синусит, конъюнктивит и пневмонию, у взрослых инфекцию дыхательных путей, главным образом у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких [14]. Инкапсулированные штаммы разделяют на 6 серотипов (Hia-f). Серотип Hib является основным возбудителем бактериального менингита среди детей во всем мире [15].

Neisseria meningitidis — грамотрицательная бактерия, которая бессимптомно колонизирует носоглотку у 4–20% людей [16]. Основной путь передачи патогена воздушно-капельный от человека к человеку. Менингококки могут вызывать опасные для человека заболевания, такие как менингококковая септицемия, менингит или пневмония [17].

Escherichia coli — грамотрицательная, неспоровая, факультативно анаэробная бактерия семейства Enterobacteriaceae [18]. Несмотря на то что накоплено огромное количество данных о патогенности E. Coli, вызывающей кишечные, урологические заболевания, заболевания центральной нервной системы и кровотока, имеется мало данных об инфекциях в легких [19].

Pseudomonas aeruginosa — грамотрицательный облигатный аэроб. Является условно-патогенным микроорганизмом, который вызывает заболевания у людей с ослабленным иммунитетом. Наиболее часто становится возбудителем внутрибольничных инфекций. P. aeruginosa провоцирует заболевания различной этиологии, при этом часто поражаются дыхательная система и мочевыводящие пути [20].

Staphylococcus aureus — грамположительный условно-патогенный микроорганизм, вызывающий широкий спектр заболеваний. Примерно 30% людей во всем мире являются носителями S. aureus. Является частым возбудителем нозокомиальных инфекций [21].

Acinetobacter baumannii — грамотрицательная коккобацилла. Вызывает в основном внутрибольничные инфекции. A. baumannii является основным возбудителем внутригоспитальной пневмонии, связанной с ИВЛ [22].

Klebsiella pneumonia — грамотрицательная инкапсулированная неподвижная бактерия, которая обитает в окружающей среде, в том числе в почве и поверхностных водах [23]. K. pneumoniae может провоцировать серьезные инфекции у людей с ослабленным иммунитетом, такие как пневмония, бактериемия или менингит [24].

Модели пневмонии с использованием лабораторных животных

Модель пневмонии можно воспроизвести на разнообразных видах животных. Выбор вида животных зависит от задач, поставленных в исследовании. Самыми недорогими и с этической точки зрения наиболее привлекательными являются немлекопитающие животные (насекомые и рыбы). Использование таких моделей дает ограниченный результат, но может быть полезно для получения информации о врожденных иммунных реакциях организма и вирулентных свойствах патогенных микроорганизмов, вызывающих бактериальные инфекции легких [25].

Также можно встретить исследования на свиньях и собаках. Самой предпочтительной моделью в трансляционных исследованиях легких являются некрупные животные (например, грызуны). Такие модели идеально соответствуют принципам 3R, небольшой размер и высокая скорость размножения делают их наиболее практичными и доступными для лабораторных исследований [26].

Модели на мышах

Модели на мышах часто используют при изучении пневмококковой пневмонии. Поскольку основные исследования проводятся на мышах, то имеется огромное количество научных работ, связанных с изучением организма мыши и иммунитета в целом. Наиболее часто используют мышей для оценки эффективности антибиотиков, фармакокинетики, патогенеза заболевания, факторов вирулентности и тестирование вакцин [27].

Модели пневмонии на мышах позволяют анализировать различные параметры, включая выживаемость животных после заражения, присутствие бактерий в легких и крови, уровни воспаления и гистологию ткани легких. Кроме того, используются при количественной оценке титров антител и противомикробных препаратов, в фармакокинетических исследованиях вакцин и лекарственных препаратов [28]. При исследовании пневмонии мышей содержат в индивидуально-вентилируемой системе для защиты персонала и окружающей среды от инфекционных агентов [29].

Как у людей, так и у мышей пневмококковая инфекция является результатом сложного взаимодействия бактериальных факторов и факторов хозяина, что сильно влияет на тяжесть и локализацию заболевания. Различные линии мышей по-разному реагируют на пневмококковую нагрузку с точки зрения сроков, тяжести и исхода заболевания, и это не всегда может быть транслировано на человека.

Модели на крысах

Модели на крысах используются редко по сравнению с мышами для моделирования бактериальных инфекций легких. Более крупные размеры органов сравнительно с мышами позволяют собрать больше биологического материала, однако экспериментальные группы обычно меньше, из-за чего может быть значительная погрешность в статистических результатах. Индукция легочной пневмонии осуществляется при введении инфекционного агента внутривенным, внутрибронхиальным или внутрилегочным путем. Дизайн исследований обычно основан на изучении выживаемости животных, наблюдении за общей клинической картиной, гистологическом исследовании легких, определении количества бактерий в легких и крови. Крысы в основном используются в исследованиях для изучения особенностей течения пневмонии, возникающей у пациентов с сопутствующими заболеваниями [30]. Также можно встретить научные труды, где модели экспериментальной пневмонии на крысах используются для исследования вирулентности различных пневмококковых серотипов [31] и оценки эффективности и безопасности антипневмококковой вакцинации [32].

Модели на кроликах

Модели пневмококковой пневмонии на кроликах подходят для изучения патогенеза, выживаемости, прогрессирования заболевания, а также фармакокинетических и фармакодинамических характеристик новых терапевтических и иммунизационных средств [33]. Кролики также обычно полезны для оценки различных пневмококковых серотипов и резистентных фенотипов у штаммов [34]. Модели на кроликах также подходят для изучения сепсиса. Введенные внутрибрюшинно пневмококки позволяют исследователям оценивать клинические параметры во время прогрессирования заболевания [35]. 

Модели на свиньях

Свиньи имеют сходство с людьми с точки зрения анатомии, генетики и физиологии. Животные всеядны и имеют адаптивную и врожденную иммунную систему, которая на 80% близка к человеческой [36]. В сравнении с грызунами и более мелкими животными модели на свиньях из-за своих размеров и схожей анатомии с человеком используют для проведения различных хирургических и нехирургических процедур [37]. Эксперименты на свиньях имеют большую прогностическую и терапевтическую ценность, чем исследования, проведенные на грызунах [38]. Для оценки пневмонии, связанной с ИВЛ, больше всего подходят модели на свиньях, так как животные должны находиться в положении лежа (для предотвращения ателектаза) [39].

Модели на приматах

Наиболее привлекательной моделью являются приматы, иммунитет и физиология которых сходны с человеческим и они, как правило, подвержены воздействию человеческих патогенов. Однако использование приматов в исследованиях вызывает серьезные этические проблемы [40]. Приматы не являются естественными носителями пневмококков, в исследованиях отсутствуют данные выделения пневмококков из носоглотки у приматов. Однако есть сведения об экспериментальном заражении приматов человеческим штаммом S. pneumoniae, в результате около 100% животных имели признаки колонизации через 2 нед и около 60% животных — через 7 нед после заражения, эти данные свидетельствуют о том, что приматы отличная человекоподобная модель для изучения носительства [41]. У приматов, зараженных S. Pneumoniae, развиваются аналогичные симптомы, которые наблюдаются у людей с инфекцией нижних дыхательных путей, характеризующейся лихорадкой, бактериемией, кашлем и затрудненным дыханием [42]. Приматы подходят для исследований, связанных с изучением патогенеза. Исследования легочных инфекций на бабуинах подтвердили, что возрастающие дозы пневмококковой инокуляции (серотип 19A-7) вызывают реакцию хозяина в диапазоне от легкого течения заболевания (106 КОЕ) до тяжелой пневмонии (109 КОЕ). Уровень цитокинов в бронхоальвеолярном лаваже подтвердил тяжелую пневмонию [43]. Другая группа исследователей показала, что у павиана, зараженного S. pneumoniae (серотип 4) 109 КОЕ, через 4 дня после заражения возникли симптомы бактериальной пневмонии. Клинические результаты были аналогичны тем, которые развивались у людей, и включали кашель, тахипноэ, одышку, тахикардию и лихорадку. У всех животных развились лейкоцитоз и бактериемия через 24 ч после заражения. Тяжелая воспалительная реакция после заражения нашла свое отражение в повышении уровня сывороточных цитокинов, включая интерлейкины (IL) 1Ra, IL-6 и IL-8. УЗИ легких выявило пораженные пневмонией доли легких, что было подтверждено при патоморфологическом исследовании. Выраженность патологии легких имела высокую степень корреляции с тяжестью заболевания [44].

Типы моделей пневмонии

«Один удар» — модель острой пневмонии

Эта модель пневмонии считается простой из-за метода введения бактериального инокулята в легкие. Интратрахеальная инстилляция является наиболее часто используемым методом исследования пневмонии и включает введение бактериальной суспензии непосредственно в трахею или легкие [45]. Данный метод предоставляет наиболее точный контроль над установленной дозой. Однако в этом методе приходится прибегать к хирургическому вскрытию трахеи, что влечет за собой последующее зашивание разреза, провоцирующее воспалительную реакцию в органе, что может оказать существенное влияние на конечный результат. С другой стороны, эндотрахеальное введение бактерий требует интубирования животного для облегчения закапывания бактериального раствора в легкие и является таким же точным методом, как и метод интратрахеальной инстилляции [46]. Менее инвазивными методами считают интраназальное введение, при котором установленная бактериальная доза вводится каплями в ноздри животным [47], или аэрозольное введение, которое применяют для агрессивных животных [48]. Тем не менее точная доза, достигающая нижних дыхательных путей в обоих методах, не может быть просчитана, и у животных часто развиваются инфекции верхних дыхательных путей [47] или другие инфекции, помимо пневмонии [48]. При аэрозольном методе для контроля установленной дозы требуется немедленно после аэрозолизации подвергнуть несколько животных эвтаназии для количественного подсчета бактерий [48].

Искусственная вентиляция легких как модель пневмонии

ИВЛ является важным компонентом в патогенезе пневмонии. Как было показано, при ИВЛ развивается стерильная воспалительная реакция в легких, при которой возникают различные повреждения тканей, такие как чрезмерное растяжение легких, баротравма и травма избыточным объемом, утечка воздуха из-за нарушения стенки воздушного пространства, отек легких и ателектаз (повторное открытие и закрытие альвеол) [49].

Для создания моделей ИВЛ на животных были использованы два основных способа. В первом способе бактериальная суспензия вводится в легкие до проведения ИВЛ [50], во втором бактериальную суспензию вводят после вентиляции, что имитирует более естественную эволюцию заболевания [51]. Однако при применении второго способа результаты показывают повышенную бактериальную нагрузку на легкие, более тяжелое течение заболевания и высокую смертность по сравнению с первым способом [51].

Показано, что экспериментально индуцированный стеноз трахеи наряду с длительной механической вентиляцией легких (до 4 дней) вызывает спонтанное развитие пневмонии с эндогенной микробиотой у поросят, также в данном исследовании обнаружены оппортунистические возбудители пневмонии человека, такие виды как Pseudomonas и Klebsiella [39].

Агаровая (хроническая) модель пневмонии

Данная модель первоначально была разработана на крысах и используется в области изучения муковисцидоза [52]. Для формирования биопленки в качестве внеклеточных полимерных веществ применяются гранулы альгината агара или водорослей, в которые загружаются бактерии, смешиваются с минеральным маслом и эмульгатором сорбитан-моноолеата для повышения однородности гранул. Для контрольных групп животных готовят стерильные шарики с использованием фосфатно-солевого буферного или физиологического раствора, однако стерильные шарики могут сами по себе вызвать воспалительный ответ, приводящий к увеличению клеточных инфильтратов в легких и повышенному выделению цитокинов, что может существенно повлиять на результаты исследования [53].

Интересно, что хотя бактерии могут мигрировать из агарозных шариков in vivo, бактериальный рост происходит медленно и ограничивается шариками, аналогично процессу, который наблюдается у бактерий, существующих в биопленках [54]. Кроме того, нарушается клиренс бактерий, и у животных реже развивается острый сепсис. Агаровая модель способна лучше моделировать хроническую инфекцию легких, наблюдаемую у человека, в отношении гистопатологических особенностей, повышения уровня нейтрофилов в легких и накопления цитокинов в жидкости [55].

Заключения и выводы

Наиболее часто исследователи моделируют пневмонию на мышах. Основные оцениваемые параметры исследований: сбор данных о патогенезе, выживаемости, определение количества бактерий в легких и крови, патологических и гистологических характеристик, количественная оценка титров антител. Также на мышах исследуется вирулентность бактериальных штаммов, изучаются эффективность новых антибиотиков и механизмы защиты организма. Способы введения инокулята зависят от задач, поставленных в исследовании, так, для оценки вирулентности используют внутривенный способ введения. При изучении эффективности новых антибиотиков бактериальный инокулят вводят интратрахеально. Крысы в основном используются в исследованиях для изучения особенностей течения пневмонии, вирулентности различных пневмококковых серотипов и оценки эффективности и безопасности антипневмококковой вакцинации. Модель бактериальной пневмонии на кроликах подходит для определения клинических параметров во время прогрессирования заболевания и эффективности лекарственных средств, при этом используют внутрибронхиальный и внутрибрюшинный пути введения инокулята. Эксперименты на свиньях имеют большую прогностическую и терапевтическую ценность, поэтому модели на свиньях используют при разработке терапии, направленной для лечения пневмококковой пневмонии, и вакцин. Модели на приматах подходят для исследований, связанных с оценкой тяжести заболевания. Все вышесказанное мы попытались систематизировать в таблице, которая может позволить исследователю сориентироваться во множестве моделей и выбрать дизайн исследования, соответствующий поставленным задачам.

Пневмококковая инфекция у людей разнообразна и многогранна, и ни одна экспериментальная модель на животных не способна полностью имитировать болезнь человека. Тем не менее, несмотря на ограничения, эксперименты на животных остаются, несомненно, ценным инструментом для выяснения патогенетических механизмов заболевания. Этот обзор дает представление о разработке и применении различных моделей на животных, используемых для имитации и изучения пневмонии. Все модели на животных являются полезными инструментами для выяснения аспектов патогенеза заболевания и тестирования эффективности антибиотиков и других методов лечения. Основные методы заражения описаны в этом обзоре. Использование мышей как моделей удобно с экономической точки зрения, они просты в обращении, что позволяет проводить скрининг лекарств и вакцин с высокой статистической мощностью. Более крупные животные обладают преимуществом в виде повышенной легкости выполнения хирургических процедур, но они являются более дорогостоящими, а полученные результаты могут не иметь статистической значимости из-за использования более маленьких групп.

Развитие пневмококкового заболевания зависит как от бактериальных факторов (например, капсульный серотип и другие детерминанты вирулентности), так и от факторов хозяина (например, генетический фон, иммунный ответ, возраст, пол). Прежде чем приступить к изучению пневмококковой инфекции in vivo, следует тщательно продумать выбор не только животных, но и бактериальных штаммов.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов

Л.Р. Хайбунасова – сбор данных литературных источников, сбор и анализ данных, написание и редактирование текста статьи

М.Н. Макарова – концепция и дизайн исследования, редактирование текста статьи, научное консультирование и утверждение окончательного варианта статьи для публикации

К.Е. Боровкова – редактирование текста статьи, научное консультирование

Ю.В.Салмова – оформление текста статьи