Вариабельность биохимических показателей крови и установление референсных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 2: кролики

Н.Г. Войтенко, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории биохимии и гематологии, ORCID 0000-0002-3164-4971;

М.Н. Макарова, доктор медицинских наук, директор, ORCID 0000-0003-3176-6386;

М.А. Ковалева, кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник, руководитель научно-методической группы, ORCID 0000-0002-0740-9357

АО НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ»

188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, к. 245

Е-mail: voytenko.ng@doclinika.ru

Резюме

Данные биохимического анализа являются опорными при проведении бόльшей части доклинических исследований. Установление и пересмотр референсных интервалов (РИ) биохимических показателей в отношении всех используемых видов лабораторных животных является важной задачей каждого испытательного центра. В Российской Федерации кролики широко используются для проведения различных исследований, например, при изучении общих токсических свойств оригинальных препаратов или препаратов пролонгированного действия, исследовании специфической активности препаратов, используемых для терапии органов зрения и опорно-двигательной системы и т.д. Несмотря на достаточную изученность вида в целом, данные о РИ биохимических показателей, представленные в российских периодических изданиях, ограничены. В нашем испытательном центре имеется банк данных таких показателей, которые определялись в исследованиях токсичности при многократном введении, что позволило провести ретроспективный анализ и пересмотреть имеющиеся РИ. Для расчета были использованы данные наблюдений, полученные в период с января 2018 по декабрь 2019 г. Определение биохимических показателей в данный период проводили на одном оборудовании с использованием одинаковых методик. Ретроспективный анализ данных был выполнен по 13 биохимическим показателям сыворотки крови кроликов 3 пород – новозеландские, шиншилла, белый великан. Выборка составила 127 самок и 127 самцов, возраст животных в исследованиях составлял 16–25 нед. (масса тела животных – 3–5 кг). В статье представлены РИ для креатинина, мочевины, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы (ЩФ), холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), общего белка, альбумина, глобулина, глюкозы, общего билирубина и отношения альбумин/глобулины. Обоснована необходимость создания в каждом испытательном центре внутрилабораторных баз данных РИ. Рассчитана межиндивидуальная вариабельность по указанным биохимическим показателям. Наибольшая межиндивидуальная вариабельность (>30%) установлена для таких показателей, как ЩФ, ТГ, ХС и общий билирубин. Использование именно ретроспективного анализа данных позволяет реализовать принципы 3Rs и получать более корректные данные на большей выборке лабораторных животных. Анализ полученных нами РИ в сравнении с литературными данными в целом показал их сопоставимость, что можно считать дополнительным подтверждением удовлетворительности установленных нами внутрилабораторных норм.

Введение

Во всем мире стратегия развития сферы доклинических исследований (ДКИ) нацелена на постепенное снижение числа экспериментов на животных и их замену альтернативными методами. In silico методы активно разрабатываются и предлагаются для внедрения. Однако в настоящее время полная замена лабораторных животных на альтернативные методы невозможна. Попытка валидации таких методов показывает низкую трансляционность полученных результатов в клиническую практику.

Кролик является необходимой тест-системой при изучении инновационных лекарственных препаратов, в исследованиях по изучению общих и специфических видов токсичности, фармакологической активности лекарственных препаратов без предварительного разрушения. По данным Understanding Animal Research в Англии (2018) для проведения доклинических исследований (ДКИ) было использовано 11 159 кроликов, данная цифра несопоставима с количеством мышей и крыс, используемых в ДКИ, но в 2 раза больше, чем количество морских свинок [1]. Анатомия данного вида животных позволяет моделировать различные патологии опорно-двигательного аппарата, например, остеоартроз [2, 3], а биохимический профиль и особенности метаболизма делают данный вид животных приоритетным для моделирования атеросклероза [4]. Размер данного вида лабораторных животных позволяет проводить исследования, дизайн которых предусматривает забор большого объема биоматериала (кровь, моча и т.д.), эти преимущества перед мышами и крысами делают кролика незаменимой тест-системой для проведения исследований по оценке фармакокинетических показателей [5].

Несмотря на изученность данного вида животных в отношении гематологических и биохимических показателей, очевидна необходимость регулярного пересмотра «нормальных значений» и создания баз данных референсных интервалов (РИ) с течением времени, что связано с пересмотром процессов содержания лабораторных животных, использованием новых аналитических методов. С целью реализации принципов 3Rs наиболее рационально проводить ретроспективный анализ, который позволяет включать большое количество животных [6–8]. В нашей статье представлены РИ для основных биохимических показателей, оцениваемых в ДКИ, общей токсичности, охарактеризованы статистические выбросы (СВ) для этих показателей.

Материалы и методы

Для ретроспективного анализа использовали данные, полученные в нашем центре, в рамках текущих ДКИ лекарственных препаратов в период с января 2018 по декабрь 2019 г. В исследованиях были использованы кролики пород новозеландские, шиншилла и белый великан. В массив данных включили животных интактных групп из 12 исследований. В сформированном массиве находились данные, полученные от 127 самцов и 127 самок кроликов. Были использованы небеременные и нерожавшие самки. На основании этого массива данных была рассчитана межиндивидуальная вариабельность (CVG). Также данные лабораторных животных (n=37: 23 самца и 14 самок) были использованы для расчета внутрииндивидуальной вариабельности (CVI) исследуемых показателей. Дизайн ДКИ, данные которых были использованы для расчета РИ, предусматривал двукратное измерение биохимических параметров у одного и того же животного. Были проанализированы биохимические показатели кроликов породы новозеландские, шиншилла, белый великан, возраст животных 16–25 нед, масса тела – 3–5 кг. Все ДКИ были одобрены биоэтической комиссией НПО «Дом Фармации». На протяжении с января 2018 по декабрь 2019 г. в период адаптации и последующих экспериментов животные содержались в одинаковых стандартных условиях вивария. Кроликов содержали в индивидуальных боксах с реечным полом без подстила, с зоной для отдыха (сплошной пол), снабженных автоматической ниппельной системой поения. Кормление животных проводили в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование было выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986) в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики.

Определение биохимических показателей для всех животных проводили в равных условиях с использованием принятых в нашем испытательном центре аналитических методов. В сыворотке крови этих животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (Biosystems S.A. Испания) были измерены следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза (ЩФ), холестерин (ХС), триглицериды (ТГ), общий белок, альбумин, глюкоза и общий билирубин. Для определения концентрации общего билирубина использовали набор реактивов Вектор-Бест (Россия), для остальных аналитов – наборы BioSystems S.A. (Испания). Также были рассчитаны значения глобулинов в сыворотке крови и отношение альбумин/глобулины (A/G).

Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica.10: СВ по методу Тьюки, вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка, сравнение животных разного пола — по U-критерию Манна–Уитни и t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для устранения влияния аномальных значений из массива данных были исключены СВ, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки; для этого из дальнейшей работы были исключены данные, лежащие за пределами интервала 1-го и 3-го квартилей (соответственно Q1 и Q3). Межквартильный интервал IQR определяли как Q3–Q1. Верхний и нижний пределы рассчитывали следующим образом:

Q1–1,5×IQR и Q3 +1,5×IQR [9].

После исключения СВ массивы данных были проанализированы на предмет соответствия действующим в центре РИ, которые были рассчитаны ранее с применением классического подхода, но на ограниченной выборке животных (n=20: 10 самцов, 10 самок). Данные о доле СВ по каждому показателю и выходящих за пределы РИ значений представлены в табл. 1.

Наиболее частые СВ при анализе сыворотки крови кроликов отмечали в отношении глюкозы (у самцов), а также при анализе расчетного показателя A/G (4,7 и 8,7% у самцов и самок соответственно).

При сравнении действующих РИ, полученных на малой выборке (10 самцов и 10 самок) и РИ, проанализированных ретроспективно на выборке (127 самцов и 127 самок), наибольшие отличия были отмечены для ХС и общего билирубина в сыворотке крови самцов (у 10,3 и 15,7% соответственно), а также для расчетных показателей – глобулинов (у 10,4% самцов и 14,2% самок) и A/G (у 14% самцов). В соответствии с рекомендациями [3] выход за пределы РИ >10% вновь полученных результатов свидетельствует о необходимости пересмотра этого РИ.

С этой целью РИ для полученных результатов в зависимости от вида их распределения рассчитывали как среднее ± 1,96 × стандартное отклонение (Хср±1,96 SD) — для нормального распределения и как промежуток 2,5–97,5 процентили (pr) — для ненормального распределения. Вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка. Дополнительно проводили сравнение между животными разного пола методами непараметрической статистики для ненормального распределения (U-критерий Манна–Уитни) и методами параметрической статистики для нормально распределенных данных (t-критерий Стьюдента).

При использовании параметрической статистики выявлено, что концентрация креатинина и мочевины в крови самок статистически значимо выше, чем у самцов. В человеческой популяции концентрация креатинина выше у мужчин, чем у женщин, т.е. наблюдается противоположенная тенденция по сравнению с данными для лабораторных животных [4, 5]. Установлено, что концентрация ХС в крови самок статистически значимо выше по сравнению с самцами. Также отмечено, что в сыворотке крови самок статистически значимо выше концентрации общего белка, глобулинов и соотношение A/G. Описанные тенденции, как правило, связаны с особенностями метаболизма каждого вида, в том числе с эстральными циклами. Полученные данные представлены в табл. 2.

Кролик является хорошо изученной тест-системой. Для данного вида лабораторных животных достаточно полно изучены биохимические показатели крови. В табл. 3 представлены диапазоны значений, а также средние значения и стандартное отклонение (М±SD) основных биохимических показателей крови,  полученной от кроликов разных пород. Представленные значения были переведены в единицы измерения, принятые в нашем испытательном центре.

При сравнении значений РИ, полученных в нашем испытательном центре, с литературными данными показано, что в целом диапазоны РИ схожи. Тем не менее встречаются некоторые отличия, например, в литературных данных описаны более высокие значения для следующих показателей: креатинин, АСТ, ТГ, глобулин, общий билирубин и глюкоза. При этом РИ для показателя ЩФ описаны более низкие значения. Данные отличия могут быть обусловлены множеством факторов – породой кроликов, возрастом, условиями их содержания, сезонов, в которые были получены данные, а также применяемыми аналитическими методами. В статье D.M. Black et al. представлен РИ по показателю глюкоза, который составляет 6,2–21,8 ммоль/л для самцов и 6,9–20,0 – для самок. Следует отметить, что эти данные характерны для породы калифорнийских кроликов.

Представленные данные еще раз подтверждают необходимость создания в каждом испытательном центре внутрилабораторных баз данных РИ для каждого вида животных. Ретроспективный анализ позволяет оценивать большие выборки с полным соблюдением принципов 3Rs. Для расчета РИ следует использовать значения тех или иных показателей, которые были получены от интактных (клинически здоровых животных), содержащихся в равных условиях с использованием одинаковых аналитических методов.

Для каждого показателя были рассчитаны коэффициенты вариации (CV=SD/Хср.×100%), что в грубом приближении соответствует межиндивидуальной вариабельности (CVG) этих показателей в человеческой популяции. Следует отметить, что расчет коэффициентов вариации для человека был основан на значениях банка данных из большого ряда работ, появившихся в литературе за 1951–1998 гг. Для расчета межиндивидуальной вариабельности (CVG) показателей кроликов мы использовали данные 127 самцов и 127 самок, для расчета внутрииндивидуальной вариабельности (CVI) – данные от 37 лабораторных животных. Сравнительные данные по 2 видам приведены в табл. 4.

При анализе данных табл. 4 можно отметить сходную с человеком вариабельность по большинству исследованных показателей. Обращает на себя внимание обратная картина по вариабельности активности аминотрансфераз: у людей активность АЛТ изменяется в значительно более широком диапазоне, чем у кроликов, в то время как активность АСТ демонстрирует обратную тенденцию. При этом в абсолютных значениях активность аминотрансфераз в крови кроликов сопоставима с таковой у человека (до 41 Ед/л). Межиндивидуальная вариабельность активности ЩФ, концентрации ТГ, общего билирубина и особенно ХС, общего белка, альбумина и глюкозы в крови кроликов значительно выше, чем у человека.

Внутрииндивидуальная вариабельность концентрации ХС, общего белка, альбумина и билирубина также значительно превышает соответствующие показатели у людей. Предположительно это может быть связано как с видовыми особенностями метаболизма (для ХС и альбумина), так и с методическими особенностями измерения (для общего белка и билирубина). Последнее предположение создает предпосылки для обязательного проведения валидации, применяемых в испытательном центре биохимических методик.

Заключение

Представленные результаты подтверждают необходимость и актуальность создания и периодического пересмотра РИ для каждого вида лабораторных животных, используемых для проведения ДКИ в испытательном центре. Недопустимо руководствоваться только литературными данными, поскольку даже в случае сравнения РИ по показателям, полученным на одной породе лабораторных животных, могут наблюдаться отличия, связанные с особенностями содержания лабораторных животных, применяемыми аналитическими методами и прочими условиями.

Использование именно ретроспективного анализа данных позволяет реализовать принципы 3Rs и получать более корректные данные на большей выборке лабораторных животных. Анализ полученных нами РИ в сравнении с литературными данными показал сопоставимость полученных значений РИ, что можно считать дополнительным подтверждением удовлетворительности полученных РИ.

Сравнительный анализ межиндивидуальной и внутрииндивидуальной вариабельностей биохимических показателей крови кролика и человека демонстрирует необходимость использования достаточного количества наблюдений, обязательной адаптации и валидации методики для каждого вида животных. Наличие видовых различий необходимо учитывать при рассмотрении результатов ДКИ.

Благодарности

Работа выполнена без спонсорской поддержки.

Вклад авторов

Войтенко Н.Г. – идея, планирование, разработка дизайна, сбор и систематизация материала, написание, редактирование текста.

Макарова М.Н. – идея, разработка дизайна.

Ковалева М.А. – анализ и интерпретация результатов, написание, редактирование текста.

Сведения о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Список литературы

  1. Animal Research Numbers in 2018. Дата обращения 13.04.2020, URL.: http://www.understandinganimalresearch.org.uk/news/communications-media/animal-research-numbers-in-2018/
  2. Щелкунова Е.И., Воропаева А.А., Русова Т.В., Штопис И.С. Применение экспериментального моделирования при изучении патогенеза остеоартроза (обзор литературы) // Сибирский научный медицинский журнал. – 2019; 39 (2): 27–39. [Shchelkunova E.I., Voropaeva A.A., Rusova T.V., Shtopis I.S.V. Primenenie eksperimental'nogo modelirovaniya pri izuchenii patogeneza osteoartroza (obzor literatury) //sibirskii nauchnyi meditsinskii zhurnal. – 2019; 39, № 2: 27–39. (In Russ.)].
  3. Yoshioka M., Coutts R.D., Amiel D., Hacker S.A. Characterization of a model of osteoarthritis in the rabbit knee // Osteoarthritis Cartilage. – 1996; 4 (2): 87–98.
  4. Dornas W.C., Oliveira T.T., Augusto L.E., Nagem T.J. Experimental atherosclerosis in rabbits // Arq Bras Cardiol. – 2010; 95 (2): 272–278. DOI: 10.1590/s0066-782x2010001200020
  5. Xiao X., Pei L., Jiang L.J., Lan W.X., Xiao J.Y., Jiang Y.J., Wang Z.Q. (2018) In Vivo Pharmacokinetic/ Pharmacodynamic Profiles of Danofloxacin in Rabbits Infected With Salmonella typhimurium After Oral Administration // Front. Pharmacol. – 2018; 9: 1–8 DOI: 10.3389/fphar.2018.0039.
  6. Батракова Л.Г. Теория статистики: учебное пособие. – М.: КНОРУС, 2016. – 528 с. [Batrakova L.G. Teoriya statistiki: uchebnoe posobie. – M.: KNORUS. – 2016; 528 p. (In Russ.)].
  7. ГОСТ Р53022-3-2008. Технологии лабораторные и клинические. Требования к качеству лабораторных исследований. Правила оценки клинической эффективности лабораторных тестов. – М., 2008. [GOST R53022-3-2008. Tekhnologii laboratornye i klinicheskie. Trebovaniya k kachestvu laboratornykh issledovanii. Pravila otsenki klinicheskoi effektivnosti laboratornykh testov. – M., 2008. (In Russ.)]
  8. ГОСТ Р 53022.2-2008 Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Ч. 2. Оценка аналитической надежности методов исследования (точность, чувствительность, специфичность). [GOST R 53022.2-2008 Tekhnologii laboratornye klinicheskie. Trebovaniya k kachestvu klinicheskikh laboratornykh issledovanii. Chast' 2. Otsenka analiticheskoi nadezhnosti metodov issledovaniya (tochnost', chuvstvitel'nost', spetsifichnost'). (In Russ.)]
  9. Clinical and Laboratory Standards Institute. Defining, Establishing, and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory; Approved Guideline. 3rd Ed. – Wayne, PA, 2008.
  10. Suckow M.A., Schroeder V., Douglas F.A. The Laboratory Rabbit 2nd Edición, Edición Kindle. – 2012; 150 р.
  11. Özkan C., Kaya A., Akgül Y. Normal values of haematological and some biochemical parameters in serum and urine of New Zealand White rabbits // World Rabbit Sci. – 2012; 20: 253–259 DOI:10.4995/wrs.2012.122.
  12. Black D.M., Gilardi K.V.K., Hamilton L.P., Williams E., Williams D.F., Kelly P.A., Gardner I. Hematologic and biochemistry reference values for the endangered riparian brush rabbit (Sylvilagus Bachmani Riparius) // Journal of Wildlife Diseases. – 2009; 45 (2): 491–496.
  13. Миронова И.В., Черненков Е.Н., Черненков А.А. Показатели крови кроликов при включении в рацион пробиотической кормовой добавки Биогумитель // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. – 2017; 3: 212–215.
  14. Kurtz D.M., Travlos G.S. The Clinical Chemistry of Laboratory Animals 3 Edition Edited. 2018. 1162 p.

Вас может заинтересовать