Модуляция экспрессии молекул адгезии на клетках периферической крови у мышей СВА при гепатоканцерогенезе

О.А. Бочарова1, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией иммунофармакологии,
Р.В. Карпова1, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии,
Е.В. Бочаров1, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии,
А.А. Вершинская1, кандидат медицинских наук, младший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии,
М.А. Барышникова1, кандидат фармацевтических наук, заведующий лабораторией экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей,
Д.А. Девришов3, доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН, заведующий кафедрой иммунологии и биотехнологии,
И.В. Казеев1, кандидат технических наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунофармакологии,
В.Г. Кучеряну2, доктор медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории общей патологии нервной системы,
М.В. Киселевский1, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клеточного иммунитета

1ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России,

115478, Россия, Москва, Каширское шоссе, 24;

2ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии»,

125315, Россия, Москва, ул. Балтийская, д. 8;

3ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»,

109472, Россия, Москва, ул. академика Скрябина, 23

Е-mail: planta39@rambler.ru

Резюме

Цель работы – изучение экспрессии молекул адгезии LFA-1 (CD11a/ CD18) и Mac-1 (CD11b/CD18) на клетках периферической крови у мышей-самцов СВА (сублиния CBA/LacY) при гепатоканцерогенезе под воздействием сухого экстракта комплексного фитоадаптогена.

Контрольные мыши получали воду в качестве питья. Животные опытной группы – 0,3% водный раствор сухого экстракта комплексного фитоадаптогена в течение 1-го месяца жизни (профилактическое применение). Препарат был изготовлен по  технологии сублимирования из жидкой формы комплексного фитоадаптогена, включающего компоненты экстрактов 40 растений, в том числе Panax ginseng, Eleutherococcus senticosus, Rhodiola rosea и другие адаптогены. Уровень экспрессии CD11a и CD11b антигенов на клетках периферической крови определяли в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Параметры фиксировали у мышей в возрасте 4, 8, 22 мес. Статистический анализ результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0.

Спонтанный гепатоканцерогенез у мышей СВА сопровождался снижением экспрессии CD11a и CD11b антигенов на клетках периферической крови. Воздействие сухого экстракта комплексного фитоадаптогена способствовало повышению уровня экспрессии CD11a и CD11b антигенов по сравнению с контрольными животными. Эффективность сухого экстракта сравнима с таковой для жидкой формы фитоадаптогена, выявленной в предыдущем исследовании.

Повышение уровня молекул LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови у мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе под воздействием нетоксичного иммуномодулятора в ранний период жизни животных на примере сухого экстракта комплексного фитоадаптогена может иметь значение для усиления адгезии между иммунными эффекторами и  опухолевыми клетками.

Введение

β2-Интегрины, в частности LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1, CD11a/CD18) и Mac-1 (monocyte adhesion complex CD11b/СВ18), играют существенную роль в привлечении активированных цитотоксических лимфоцитов из периферической крови в опухолевую ткань. Контррецепторами LFA-1 и Mac-1 являются гистонеспецифические молекулы адгезии ICAM-1, участвующие также в поддержании гомотипической интеграции тканей [1].

Согласно исследованиям ряда авторов, ослабленная экспрессия ICAM-1 на мембранах опухолевых клеток представляет собой механизм, подавляющий экспрессию LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови, что снижает прикрепление иммунных эффекторов к клеткам-мишеням, а также приводит к внутриопухолевой инфильтрации лейкоцитов [2; 3]. Очевидно, что изучение возможности восстановления адгезионных контактов при опухолевом процессе может внести вклад в реализацию противоопухолевого эффекта.

Интерес в этой связи представляют фитоадаптогены, нормализующие межклеточную адгезию, усиливая процессы дифференцировки тканей и иммунологическую реактивность организма [4, 5].

На модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей СВА ранее было выявлено, что кратковременное в раннем онтогенезе воздействие на примере комплексного фитоадаптогена (КФА) в форме жидкого экстракта приводит к усилению экспрессии LFA-1 и Mac-1 интегринов на клетках периферической крови. Оно сопровождается признаками лейкоцитарной инфильтрации и деструкции гепатом, подавлением сывороточного уровня иммуносупрессивных интерлейкинов 6 и 10. Эти результаты оказались существенными для снижения частоты спонтанного опухолеобразования и увеличения продолжительности и качества жизни животных [6–9].

Однако остался невыявленным фенотип клеток, инфильтрирующих опухоль, а также не ясно, экспрессированы ли на этих клетках, в частности, адгезионные молекулы LFA-1 и Mac-1 при использовании комплексного фитоадаптогена. При этом с фармакологической точки зрения более современной и перспективной является сухая форма экстракта, практически субстанция препарата.

Таким образом, исследование возможности модуляции экспрессии молекул адгезии LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови у мышей СВА при гепатоканцерогенезе на примере нетоксичного иммуномодулятора сухого экстракта комплексного фитоадаптогена (СКФА), а также оценка значимости коррекции нарушений для усиления адгезии между иммунными эффекторами и  опухолевыми клетками весьма актуальны.

Цель исследования – изучение экспрессии молекул адгезии LFA-1 (CD11a/ CD18) и Mac-1 (CD11b/CD18) на клетках периферической крови у мышей-самцов СВА (сублиния CBA/LacY) при гепатоканцерогенезе на под воздействием  СКФА.

Материал и методы

Работа проведена на мышах-самцах высокораковой линии СВА, сублиния СВА/Lac Y [10]. Животных содержали и выводили из эксперимента в соответствии с требованиями Европейской директивы по охране животных, используемых в научных целях. Контрольные животные (n = 33) получали в качестве питья воду, животные опытной группы (n = 36) – 0,3% водный раствор СКФА в 1-й месяц жизни (профилактическое воздействие).

КФА представляет собой нетоксичную фармацевтическую композицию на основе компонентов экстрактов 40 растений, в том числе фитоадаптогенов (женьшеня, элеутерококка, аралии и др). В составе КФА определены тритерпеновые сапонины, флавоноиды, эфирные масла, аминокислоты, витамины и другие соединения. Разработаны способы его биологической и физико-химической стандартизации [11–13].Выявлены антиоксидантные, антистрессорные, гормономодулирующие, антимутагенные, противоопухолевые и иммуномодулирующие, в том числе адгезиогенные и интерфероногенные свойства [14–17]. СКФА был приготовлен из жидкой формы с использованием технологии сублимирования.

У контрольных и опытных животных в возрасте 4, 8, 22 мес на клетках периферической крови исследовали уровни экспрессии СD11a и CD11b антигенов методом непрямой иммунофлюоресценции. Оставшиеся животные находились под наблюдением вплоть до их естественной гибели.

Статистический анализ данных проводили с использованием   программы  «STATISTICA 6.0», применяя  дисперсионный анализ ONE–WAY ANOVA. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Для оценки различий между группами применяли критерий  Newman–Keuls. Статистически значимым считали различия при p <0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты воздействия СКФА на экспрессию CD11a антигена клетками крови у мышей-самцов  СВА в онтогенезе представлены в табл. 1, из которой видно, что в возрасте 4 и 8 мес у мышей обеих групп количество клеток, экспрессирующих CD11a антиген, статистически не различалось (p≥0,5). К 22-месячному возрасту у мышей контрольной группы выявлено статистически достоверное снижение этого показателя с 45,9±3,4% (в возрасте 8 мес) до 36,5±1,9% (р8–22=0,03). У мышей опытной группы  к 22 мес изменение экспрессии CD11a антигена по сравнению с ранним периодом онтогенеза происходит статистически не значимо (52,3±3,0 и 44,6±2,1% соответственно, р4–22=0,05). По сравнению с 8 месячным возрастом этот показатель статистически не различался (р8–22=0,2). Отметим, что значение этого показателя оказалось выше в сравнении с аналогичным периодом онтогенеза (22 мес) у контрольных мышей (р1–2=0,01).

 

Таблица 1

Экспрессия CD11a антигена на клетках периферической крови у мышей  СВА при воздействии сухого экстракта  комплексного фитоадаптогена

Группа животных

CD 11a+ клетки, %

4 мес

8 мес

22 мес

p

1

Контроль (интактные)

49,4±3,6

45,9±3,4

36,5±1,9

р4–8=0,5

р8–22=0,03

р4–22=0,005

 

n=33

n=11

n=10

n=11

 

2

Опыт (воздействие СКФА)

52,3±3,0

49,0±2,9

44,6±2,1

р4–8=0,4

р8–22=0,2

р4–22=0,05

 

n=36

n=11

n=10

n=11

 

 

р

р1–2=0,5

р1–2=0,5

р1–2=0,01

 

Примечание. Здесь и в табл. 2: n – количество животных;  р1–2 – различие показателя между группами; р4–8 – различие показателя в 4 и 8 мес.; р8–22 – различие показателя в 8 и 22 мес.; р4–22 – различие показателя в 4 и 22 мес.

Результаты воздействия СКФА на экспрессию CD11b антигена клетками крови мышей СВА в онтогенезе представлены в табл. 2, из даееых которой следует, что у мышей контрольной группы количество клеток, экспрессирующих CD11b антиген, в возрасте 8 мес (12,1±1,7%) достоверно не отличалось от такового у 4-месячных животных (13,4±1,7%; р4–8=0,6). В возрасте 22 мес этот показатель статистически достоверно снизился до 6,8±1,1% (р8-22=0,02; р4-22=0,004). У опытных мышей уровень экспрессии CD11b антигена в возрасте 4 и 8 мес не различался (17,2±1,5 и 15,6±1,4%; р4–8=0,5), но имел тенденцию к повышению по сравнению с контрольными животными в аналогичные периоды онтогенеза (р1–2=0,1). К 22-месячному возрасту уровень экспрессии снизился до 12,1±1,1% (р8–22=0,06; р4–22=0,01). Вместе с тем в позднем онтогенезе в данной группе уровень экспрессии CD11b антигена достоверно превышал таковое у мышей контрольной группы в этом возрасте (р1–2=0,003).  

Таблица 2

Экспрессия CD11b антигена на клетках периферической крови у мышей  СВА при воздействии сухого экстракта  комплексного фитоадаптогена

Группа животных

CD 11b+ клетки, %

4 мес

8 мес

22 мес

p

1

Контроль (интактные)

13,4±1,7

12,1±1,7

6,8±1,1

р4–8=0,6

р8–22=0,02

р4–22=0,004

 

n=33

n=12

n=12

n=12

 

2

Опыт (воздействие СКФА)

17,2±1,5

15,6±1,4

12,1±1,1

р4–8=0,5

р8–22=0,06

р4–22=0,01

 

n=36

n=12

n=12

n=12

 

 

p

р1–2=0,1

р1–2=0,1

р1–2 =0,003

 

Таким образом, согласно полученным результатам, при профилактическом воздействии СКФА у опытных мышей число клеток крови, экспрессирующих  молекулы LFA-1 (СD11a/CD18) и Mac-1 (СD11b/CD18), выше по сравнению с таковым показателем у контрольных животных.

Так как лигандами LFA-1 являются молекулы межклеточной адгезии ICAM-1, ICAM-2, возможно, что увеличение числа клеток периферической  крови, экспрессирующих интегрин CD11a, под воздействием СКФА будет способствовать более высокой  иммунореактивности таких животных в осуществлении киллинга клеток-мишеней эффекторами иммунитета (NK-клетками, цитотоксическими лимфоцитами) [18, 19].

При этом молекула Mac-1 экспрессируется на нейтрофилах, лимфоцитах и NK-клетках, являясь лигандом, в том числе ICAM-1. Поэтому аналогичные выводы уместны и в отношении повышенного уровня экспрессии CD11b антигена у мышей опытной группы  по сравнению с контрольными животными. В данном случае также возможна активация способности иммунных эффекторов инфильтрировать опухоль, контактировать с клетками-мишенями, что способствует гибели последних [20].

Заключение

На основании предшествующих и настоящих исследований можно полагать, что у мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе сниженная активность Т-лимфоцитов обусловлена, в том числе недостатком экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на эффекторах иммунитета. Фитоадаптогены, оказывающие адгезиогенное действие, способны нормализовать указанные показатели.

Таким образом, при введении СКФА в течение 1-го месяца постнатального онтогенеза высокогепатомным мышам, включая завершающий период дифференцировки нормальной ткани печени (5–15-й день постнатального развития) можно обеспечить длительный по времени эффект повышения экспрессии на клетках крови молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1.

Вместе с тем, эффективность профилактического воздействия СКФА на уровень экспрессии лейкоцитарных интегринов сравнима с таковой для жидкой формы фитоадаптогена, выявленной в предыдущем исследовании [6].

Повышение экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на клетках периферической крови при профилактическом воздействии сухого экстракта мультифитоадаптогена может иметь значение для усиления контактных взаимодействий иммунных эффекторов с опухолевыми клетками.

Вклад авторов: все авторы внесли существенный вклад в работу над статьей и несут ответственность за ее содержание.

Список литературы

  1. Schttenhelm L., Hilkens C.M., Morrison V.L. β2-Integrins as regulators of dendritic cell, monocyte, and macrophage function. Front Immunol 2017; 20 (8): 1866–77. Doi: 10.3389/fimmu.2017.01866.
  2. Бочарова О.А. Адгезионная концепция в биологии злокачественного роста. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2014; (2): 87–90.
  3. Takeichi T., Mocevicius P., Deduchovas O. et al. αLβ2-integrin is indispensable for CD8+ T-cell recruitment in experimental pancreatic and hepatocellular cancer. Int. J. Cancer 2012; 130 (9): 2067–76. Doi: 10.1002/ijc.26223.
  4. Бочарова О.А. Профилактическая онкология и фитоадаптогены. Вестник РАМН. 2009; (7): 41–5.
  5. Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarov V.G. Aralia elata var. mandshurica (Rupr. & Maxim.) J.Wen: An overview of pharmacological studies. Phytomedicine 2016; 23 (12): 1409–21. Doi: 10.1016/j.phymed.2016.07.011.
  6. Бочарова О.А., Карпова Р.В., Ильенко В.А. и др. Лейкоцитарные интегрины при гепатоканцерогенезе мышей высокораковой линии СВА. Российский биотерапевтический журнал/ 2013; 12 (3): 53–6.
  7. Бочарова О.А., Бочаров Е.В., Карпова Р.В. и др. Снижение возникновения гепатом при воздействии фитоадаптогена у высокораковых мышей СВА. Российский биотерапевтический журнал/ 2014; 13 (2): 73–6.
  8. Бочаров Е.В., Карпова Р.В., Вершинская А.А. и др. Лимфоцитарная инфильтрация гепатокарцином мышей высокораковой линии СВА при воздействии мультифитоадаптогена в раннем постнатальном онтогенезе. Российский биотерапевтический журнал/ 2015; 14 (2): 85–90.
  9. Бочаров Е.В., Карпова Р.В., Бочарова О.А. и др. Воздействие мультифитоадаптогена в раннем постнатальном онтогенезе, улучшающее выживаемость и соматическое состояние мышей высокораковой линии. Российский биотерапевтический журнал. 2017; 16 (1): 76–81. Doi: 10.17650/1726-9784-2017-16-1-76-81
  10. Модянова Е.А., Бочарова О.А., Маленков А.Г. Профилактическое действие контактинов-кейлонов на спонтанный канцерогенез у линейных мышей. Экспериментальная онкология. 1983; 5 (3): 39–42.
  11. Бочарова О.А., Барышников А.Ю. Фитоадаптогены в онкологии. М.: ЗооМедВет, 2004: 138 с.
  12. Шейченко В.И., Бочарова О.А., Шейченко О.П. и др. Аналитические возможности метода ЯМР для определения компонентов препарата Фитомикс-40. Заводская лаборатория. Диагностика материалов 2006; 72 (8): 15–23.
  13. Шейченко О.П., Бочарова О.А., Крапивкин Б.А. и др. Исследование комплексного фитоадаптогена методом ВЭЖХ. Вопр. биол. мед. фарм. химии. 2012; (10): 52–9.
  14. Бочарова О.А., Пожарицкая М.М., Чекалина Т.Л. и др. Роль адгезионных нарушений в патогенезе лейкоплакии и возможности их коррекции неспецифическим иммуномодулятором. Иммунология. 2004; 25 (1): 36–43.
  15. Бочаров Е.В., Кучеряну В.Г., Крыжановский Г.Н. и др. Влияние комплексного фитоадаптогена на МФТП-индуцированный паркинсонический синдром у мышей. Бюлл экспер биол и мед. 2006; 141 (5): 495–8.
  16. Бочарова О.А., Давыдов М.И., Клименков А.А. и др. Перспективы применения фитоадаптогена в лечении распространенного рака желудка. Бюлл экспер биол и мед. 2009; 148 (7): 96–9.
  17. Куренная О.Н., Карпова Р.В., Бочарова О.А. и др. Антимутагенез мультифитоадаптогена в клетках дрожжей-сахаромицетов. Генетика. 2013; 49 (12): 1364–9. Doi: 10.1134/S1022795413120053
  18. Li N., Yang H., Wang M. et al. Ligand-specific binding forces of LFA-1 and Mac-1 in neutrophil adhesion and crawling. Mol Biol Cell. 2018; 29 (4): 408–418. Doi: 10.1091/mbc.E16-12-0827.
  19. Sharma A., Lawry S.M., Klein B.S. et al. LFA-1 Ligation by high-density ICAM-1 is sufficient to activate IFN-γ release by innate T-lymphocytes. J. Immunol. 2018; 201 (8): 2452–61. Doi: 10.4049/jimmunol.1800537
  20. Sasada, T., Suekane S. Variation of tumor-infiltrating lymphocytes in human cancers: controversy on clinical significance. Immunotherapy. 2011; 3 (10): 1235–51.

Вас может заинтересовать