Сухачев В.С., Иванов С.М., Филимонов Д.А., Поройков В.В. Альтернативные методы исследования. Компьютерная оценка острой токсичности для грызунов. Лабораторные животные для научных исследований. 2019; 4. https://doi.org/10.29296/2618723X-2019-04-04
Определение значений полулетальных доз (LD50) для грызунов является обязательным этапом экспериментальных доклинических исследований фармакологических веществ. Возможность in silico (расчетной) оценки величины LD50 при 4 способах введения вещества (внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный, подкожный) реализована нами с использованием компьютерной программы GUSAR (General Unrestricted Structure-Activity Relationships), как в локальной версии (для крыс и мышей), так и в виде веб-сервиса, свободно доступного через Интернет (для крыс). При выполнении прогноза величины LD50 для анализируемого соединения осуществляется оценка его попадания в область применимости используемой QSAR модели, и соответствующая информация предоставляется исследователю. На примере прогноза величины LD50 для местного анестетика прокаина продемонстрированы возможности и ограничения компьютерного прогнозирования острой токсичности. Показано, что при отсутствии экспериментальных значений LD50 можно использовать расчетные значения, полученные с применением построенных нами QSAR моделей, поскольку при наличии как экспериментальных, так и расчетных значений LD50, в большинстве случаев отнесение к классу опасности в обоих случаях одинаково. В информационной системе ChemIDplus найдены экспериментальные данные по острой токсичности нескольких местных анестетиков (Benzocaine, Butamben, Chloroprocaine hydrochloride) для мышей и крыс. Однако в них приведена лишь информация для некоторых путей поступления препарата в организм. Соответствующие «пропуски» в данных были дополнены расчетными оценками, полученными на основе моделей GUSAR. Нами разработан метод генерации сети метаболизма ксенобиотиков в организме человека для 15 типов реакций биотрансформации, осуществляемых 8 основными изоформами цитохрома P450 и различными трансферазами, гидролазами и эстеразами, участвующими в биотрансформации ксенобиотиков. Создан общедоступный веб-ресурс MetaTox (http://www.way2drug.com/mg) для оценки интегральной токсичности ксенобиотиков с использованием построенных нами QSAR моделей, с учетом структуры исходного соединения и его метаболитов. С помощью компьютерного прогноза можно отобрать наиболее безопасные соединения для экспериментального тестирования острой токсичности среди различных веществ, обладающих требуемым фармакологическим действием, что позволяет снизить число экспериментов на лабораторных животных.
Тестирование безопасности на лабораторных животных является обязательным этапом доклинических исследований фармакологических веществ [1]. В процессе поиска и разработки нового лекарственного препарата изучают биологическую активность в среднем 5–10 тыс. органических соединений [2], поэтому снижение числа экспериментов на лабораторных животных имеет особое значение [3]. Это актуально как по экономическим, так и по этическим соображениям, поскольку экстраполяция на человека экспериментальных результатов, полученных на животных, не всегда успешна [4].
Правило «трех О» (3 R – Replacement, Reduction, Refinement), согласно которому необходимо: ограничить использование животных; оптимизировать эксперименты, чтобы свести к минимуму страдания животных; отказаться от тех испытаний, которые можно заменить альтернативными методиками, – было предложено еще в 1959 г. [5]. В качестве альтернативных (по отношению к использованию лабораторных животных) методов для оценки безопасности фармакологических веществ рассматриваются возможности применения других организмов (низших позвоночных, беспозвоночных, микроорганизмов), клеточных и тканевых культур (токсикология in vitro), а также компьютерного моделирования (токсикология in silico) [6]. Преимуществом расчетных оценок токсикометрических характеристик фармакологических веществ является возможность их получения на ранних стадиях исследования, поскольку прогноз может быть выполнен на основе структурной формулы виртуального соединения, дизайн которого осуществлен в компьютере [7].
В настоящей работе представлена возможность компьютерного прогноза полулетальной дозы LD50 для мышей и крыс при 4 путях введения фармакологического вещества на основе моделей количественных зависимостей «структура‑острая токсичность» (QSAR моделей), построенных с использованием программы GUSAR. Поскольку определение значений LD50 осуществляется на ранних этапах доклинических исследований [8], компьютерные оценки позволяют существенно сократить число изучаемых соединений, а следовательно и количество используемых в эксперименте лабораторных животных.
Разработанная нами компьютерная программа GUSAR предназначена для построения моделей количественных зависимостей между структурой и различными свойствами органических молекул [9]. В GUSAR используются дескрипторы количественных атомных окрестностей QNA (Quantitative Neighbourhoods of Atoms), некоторые физико-химические дескрипторы и (в качестве дополнительных параметров) результаты прогноза 3663 видов активности с помощью программы PASS [10]. Современный алгоритм GUSAR основан на разработанном нами ранее методе самосогласованной регрессии [11], который дополнен оценками ближайших соседей, искусственной нейронной сетью с радиальной базисной функцией и консенсусом оценок многих моделей [12]. Сопоставление первой версии программы GUSAR с широко используемыми для анализа количественных соотношений «структура‑активность» методами CoMFA, CoMSIA, HQSAR и др. продемонстрировало преимущества реализованного в GUSAR подхода [10].
С помощью программы GUSAR были построены QSAR модели зависимостей «структура‑острая токсичность» при 4 способах введения фармакологического вещества (внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный, подкожный) для мышей и крыс. Характеристики построенных моделей приведены в табл. 1.
Таблица 1
Характеристики моделей
Животные, путь введения |
N |
R2 |
Q2 |
F |
SD |
V |
Мыши, внутрибрюшинно (IP) |
25086 |
0.993 |
0.612 |
60.161 |
0.403 |
554 |
Мыши, внутривенно (IV) |
9621 |
0.994 |
0.610 |
30.795 |
0.402 |
402 |
Мыши, перорально (Oral) |
18189 |
0.994 |
0.580 |
43.224 |
0.384 |
488 |
Мыши, подкожно (SC) |
3215 |
0.996 |
0.634 |
12.087 |
0.520 |
338 |
Крысы, внутрибрюшинно (IP) |
3191 |
0.997 |
0.598 |
9.868 |
0.526 |
328 |
Крысы, внутривенно (IV) |
1183 |
0.998 |
0.700 |
10.740 |
0.548 |
181 |
Крысы, перорально (Oral) |
8075 |
0.996 |
0.666 |
31.355 |
0.528 |
426 |
Крысы, подкожно (SC) |
976 |
0.998 |
0.617 |
6.994 |
0.638 |
142 |
Примечание. N – число соединений в обучающей выборке, данные по которым были использованы при построении моделей; R2 – коэффициент детерминации, характеризующий описательную способность модели; Q2 – коэффициент детерминации при скользящем контроле с исключением по одному, характеризующий предсказательную способность модели; F – значение критерия Фишера; SD – стандартное отклонение; V – число переменных в консенсусной модели.
Согласно данным табл. 1, статистические характеристики, характеризующие качество построенных зависимостей, удовлетворяют современным требованиям [13], что позволяет их использовать для оценки величин LD50 на основе структурных формул анализируемых веществ.
Важно отметить, что при выполнении прогноза величины LD50 для анализируемого соединения осуществляется оценка его попадания в область применимости (Applicability Domain) соответствующей QSAR модели. С этой целью выполняется расчет среднего сходства структурной формулы этого соединения со структурными формулами 3 ближайших по структуре соседей. Если эта величина превышает 0,7, соединение соответствует области применимости модели (in AD); в противном случае – соединение не соответствует области применимости модели (out of AD).
Прогноз величины LD50 для мышей и крыс при 4 путях поступления фармакологического вещества в организм может быть получен с использованием построенных моделей в локальной версии GUSAR, инсталлированной на компьютере пользователя. Чтобы предоставить доступ к нашим программам широкому кругу исследователей, соответствующий прогноз для крыс мы реализовали в виде веб-сервиса, свободно доступного в сети Интернет [14, 15].
На примере оценки острой токсичности для препарата Прокаин рассмотрим возможности и ограничения компьютерного прогноза.
Местный анестетик прокаин [(2-(диэтиламино)этил-4-аминобензоат (в виде гидрохлорида)] введен в медицинскую практику в 1905 г. и применяется до сих пор [16], что свидетельствует об его относительной безопасности.
Оценка острой токсичности для мышей была нами получена с использованием локальной версии программы GUSAR. Результаты прогноза (во всех случаях имеется соответствие области применимости моделей) в сопоставлении с экспериментальными значениями приведенными в табл. 2.
Таблица 2
Результаты прогноза и экспериментальные данные, полученные для мышей
Животные, путь введения |
Прогноз LD50, мг/кг |
Эксперимент LD50, мг/кг [17] |
Мыши, внутрибрюшинно (IP) |
288 |
165 |
Мыши, внутривенно (IV) |
1211 |
33 |
Мыши, перорально (Oral) |
92 |
175 |
Мыши, подкожно (SC) |
222 |
192 |
Как видно из приведенных в табл. 2 данных, в 3 из 4 случаев имеется соответствие предсказанных и экспериментальных результатов; в этих случаях согласно ГОСТ 12.1.007-76, вещество может классифицироваться как «Умеренно опасное» [18]. При внутривенном введении мышам прокаина, согласно прогнозу, вещество может быть отнесено к классу «Малоопасных», в то время как, согласно эксперименту, оно может быть, – «Умеренно опасным».
Прогноз острой токсичности для крыс при 4 путях поступления препарата в организм был выполнен нами с использованием соответствующего веб-сервиса [15]. Для ввода структурной формулы Прокаина был использован встроенный химический редактор Marvin JS [19]. Он позволяет нарисовать структурную формулу изучаемой молекулы непосредственно в браузере, либо, кликнув на иконке открыть MOL файл [20] со структурной формулой, нарисованной в любом химическом редакторе и сохраненной на компьютере пользователя. Введенная структурная формула будет отражена в окошке химического редактора (рис. 1).
Затем следует нажать кнопку Predict для получения прогноза. Прогноз предоставляется пользователю в виде 3 таблиц, 1-я из которых содержит результаты прогноза LD50 в виде обратного десятичного логарифма в ммоль/кг; 2-я – в мг/кг, а 3-я – отнесение к различным классам опасности по классификации ОЭСР – Организация экономического сотрудничества и развития (табл. 3).
Таблица 3
Классификация, разработанная Организацией экономического сотрудничества и развития
Rat IP LD50 Log10(mmol/kg) |
Rat IV LD50 log10(mmol/kg) |
Rat Oral LD50 log10(mmol/kg) |
Rat SC LD50 log10(mmol/kg) |
-0,103 in AD |
-0,696 in AD |
0,893 in AD |
0,620 in AD |
Rat IP LD50 (mg/kg) |
Rat IV LD50 (mg/kg) |
Rat Oral LD50 (mg/kg) |
Rat SC LD50 (mg/kg) |
186,500 in AD |
47,580 in AD |
1847,000 in AD |
985,100 in AD |
Rat IP LD50 Classification |
Rat IV LD50 Classification |
Rat Oral LD50 Classification |
Rat SC LD50 Classification |
Class 4 in AD |
Class 4 in AD |
Class 4 in AD |
Class 4 in AD |
Во всех случаях приводятся результаты оценки соответствия результатов прогноза области применимости соответствующих моделей. Согласно представленным в таблицах данным, при всех 4 путях введения препарата вещество относится к 4-у классу опасности («Умеренно опасное»).
Ниже приведено сопоставление прогнозируемых и экспериментальных значений LD50 (табл. 4).
Таблица 4
Прогнозируемые и экспериментальные значения LD50
Животные, путь введения |
Прогноз LD50, мг/кг |
Эксперимент LD50, мг/кг [17] |
Крысы, внутрибрюшинно (IP) |
187 |
160 |
Крысы, внутривенно (IV) |
48 |
38 |
Крысы, перорально (Oral) |
1847 |
200 |
Крысы, подкожно (SC) |
985 |
597 |
Указанные в табл. 4 данные показывают, что наибольшие различия наблюдаются для значений LD50 при пероральном пути поступления препарата в организм; однако во всех случаях отнесение веществ к классам опасности одинаковое.
Анализ наличия экспериментальных данных по острой токсичности нескольких местных анестетиков для мышей и крыс в информационной системе ChemIDplus [17] показал, что эти данные приведены лишь при некоторых путях поступления препарата в организм. Соответствующие «пропуски» в данных, обозначенные как «–», могут быть дополнены расчетными оценками, полученными с использованием GUSAR (табл. 5).
Таблица 5
Расчетные данные, полученные с помощью GUSAR
Benzocaine |
|
Животные, путь введения |
LD50, мг/кг эксперимент/прогноз |
Мыши, внутрибрюшинно (IP) |
216/85 (out of AD) |
Мыши, внутривенно (IV) |
–/234 |
Мыши, перорально (Oral) |
2500/15 |
Мыши, подкожно (SC) |
–/43 |
Крысы, внутрибрюшинно (IP) |
–/721 |
Крысы, внутривенно (IV) |
–/86 |
Крысы, перорально (Oral) |
3042/2563 |
Крысы, подкожно (SC) |
–/964 |
Butamben |
|
Животные, путь введения |
LD50, мг/кг эксперимент/прогноз |
Мыши, внутрибрюшинно (IP) |
67/133 (out of AD) |
Мыши, внутривенно (IV) |
–/526 |
Мыши, перорально (Oral) |
–/17 |
Мыши, подкожно (SC) |
–/60 |
Крысы, внутрибрюшинно (IP) |
–/661 |
Крысы, внутривенно (IV) |
–/78 |
Крысы, перорально (Oral) |
–/2713 |
Крысы, подкожно (SC) |
–/1896 |
Chloroprocaine hydrochloride |
|
Животные, путь введения |
LD50, мг/кгэксперимент/прогноз |
Мыши, внутрибрюшинно (IP) |
266/242 |
Мыши, внутривенно (IV) |
–/1441 |
Мыши, перорально (Oral) |
–/96 |
Мыши, подкожно (SC) |
700/184 |
Крысы, внутрибрюшинно (IP) |
–/243 |
Крысы, внутривенно (IV) |
–/47 |
Крысы, перорально (Oral) |
–/1759 |
Крысы, подкожно (SC) |
–/1525 |
Согласно данным табл. 5, при наличии экспериментальных и предсказанных значений, как правило, отнесение к классам опасности одинаково. Лишь в 2 случаях прогноз выходит за рамки области применимости QSAR моделей; оценки остальных значений могут быть использованы на практике.
Большинство фармакологических веществ могут взаимодействовать с несколькими и даже многими молекулярными мишенями и обладают сложными профилями биологической активности. При поступлении в организм человека они подвергаются биотрансформации с образованием одного или нескольких метаболитов, которые могут иметь другие профили биологической активности. Авторами в рамках проекта РНФ № 14-15-00449 «Интегральная оценка токсичности ксенобиотиков с учетом их метаболизма в организме человека изоформами 3A4, 2C9, 2C19, 2D6, 1A2 цитохрома P450» разработан метод генерации сети метаболизма ксенобиотиков в организме человека для 15 типов реакций биотрансформации, осуществляемых 8 основными изоформами цитохрома P450 и различными трансферазами, гидролазами и эстеразами, участвующими в метаболизме ксенобиотиков, а также создан общедоступный веб-ресурс MetaTox (http://www.way2drug.com/mg) для интегральной оценки токсичности ксенобиотиков. В новом проекте РНФ № 19-15-00396 «Анализ профилей биологической активности органических соединений с учетом их метаболизма в организме человека для поиска и создания новых лекарств» ведется разработка методов прогноза метаболической стабильности органических соединений, развитие методов генерации сетей их метаболизма в организме человека с оценкой принадлежности гипотетических метаболитов к классам основных или минорных, расширение спектра прогнозируемых классов реакций биотрансформации, усовершенствование алгоритмов прогноза спектров биологической активности и анализа связей между действием на молекулярные мишени и фармакологическими эффектами с учетом одновременного воздействия на многие мишени, разработка методов агрегации множества оценок биологической активности органических соединений и их метаболитов, в том числе детального анализа возможных токсических эффектов.
Таким образом, на основе компьютерной программы GUSAR нами реализована in silico оценка величины LD50 при 4 способах введения фармакологического вещества (внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный, подкожный). Прогноз для крыс и мышей возможен с использованием локальной версии программы; для крыс – также в виде веб-сервиса, свободно доступного через Интернет [15]. На примере местного анестетика Прокаин продемонстрировано, какие действия должен осуществить пользователь для получения прогноза с помощью нашего веб-сервиса. На примере других местных анестетиков показано, что при отсутствии экспериментальных значений LD50 в информационной системе ChemIDplus, можно применять расчетные значения, полученные с помощью построенных нами QSAR моделей. Такая возможность обоснована тем, что в большинстве случаев при наличии как экспериментальных, так и теоретических значений полулетальных доз, отнесение к классу опасности в обоих случаях одинаково. Поскольку прогноз GUSAR основан на анализе количественных зависимостей «структура–острая токсичность» для гетерогенной обучающей выборки, аналогичный подход может быть применен также к веществам из других химических классов, обладающих иными фармакотерапевтическими эффектами. Применение компьютерного прогноза дает возможность отобрать наиболее безопасные соединения среди различных веществ, оказывающих требуемое фармакологическое действие, что позволяет снизить число экспериментов на лабораторных животных.
Благодарности. Работа выполняется при поддержке Российского научного фонда (грант № 19-15-00396).