Моделирование у мышей C57BL/6J повторной описторхозной инфекции трематодой O. felineus (Rivolta, 1884)

Введение

Описторхоз — инфекционное заболевание, возникающее при попадании личинок трематод семейства Opisthorchiidae в желудочно-кишечный тракт млекопитающих. Инфицирование происходит при поедании недостаточно термически обработанной рыбы из семейства карповых (Cyprinidae), которая является носителем метацеркарий — личинок этого опасного для человека паразита. Основной возбудитель описторхоза в Европе и России — представитель данного семейства — кошачья двуустка, Opisthorchis felineus (O. felineus). В качестве дефинитивного хозяина O. felineus, кроме человека, зарегистрировано 33 вида рыбоядных млекопитающих [1]. Самый крупный очаг O. felineus-индуцированного описторхоза находится в Обь-Иртышском бассейне. Степень зараженности населения в прибрежных областях рек Обь и Иртыш, охватывающих 14 регионов РФ и 4 региона Казахстана с населением приблизительно 15 млн человек, равна 500 человек на 100 000 населения, при этом в некоторых сельских районах средней части реки Обь эта величина достигает 100% [2, 3].

Внедряясь в желчные протоки печени, личинки O. felineus способствуют развитию заболеваний, прежде всего печени. На фоне хронического описторхоза развиваются такие заболевания, как холангит, холангиохолецистит, холангиогепатит, холангитический цирроз печени [4]. Отмечают связь между описторхозом, вызванным O. felineus, и опухолями в печени [5, 6]. Кроме того, описторхоз рассматривают как системное заболевание, при котором происходят нарушения в других органах и системах организма, вплоть до центральной нервной системы (ЦНС) [7].

Актуальность исследования особенностей инвазии паразита и системных изменений в организме хозяина после заражения O. felineus обусловлена продолжающимся поиском эффективной терапии этого заболевания. Однако проведение этих исследований требует удобных, дешевых и легко воспроизводимых моделей описторхоза. Чаще всего описторхоз моделируют на сирийских хомячках, что объясняется лучшей приживаемостью описторхид у этих животных. Иногда исследования проводят на других представителях млекопитающих (лисицах, песчанках, крысах), еще реже используют мышей, хотя в природных популяциях гельминт O. felineus обнаруживается у разных мышеобразных грызунов (водяная и европейская рыжая полевка, малая лесная, желтогорлая, полевая и домовая мыши) [8]. Обнаружена равная степень заражения личинками O. felineus у сирийских хомячков и мышей линии C57BL/6 на острой стадии (2 нед) экспериментального описторхоза [9], тогда через 6 мес после инфицирования наблюдаются значительные межвидовые различия по количеству паразитов в желчных протоках печени. При равной дозе инфицирования (100 метацеркарий на 1 животное) у хомячков отмечалось 32,0±2,0 паразитов [10], тогда как у мышей только 10,9±4,0 [11]. Однако учитывая разницу в массе печени у инфицированных животных (около 2 г – у мышей и 6,5–7 г – у хомячков), паразитарная нагрузка (количество паразитов на 1 г печени) у 2 видов животных оказалась сопоставимой. На основании этих данных было высказано предположение, что мыши линии C57BL/6J также могут быть использованы для моделирования описторхоза в лабораторных условиях.

Поскольку в природных популяциях инфицирование млекопитающих происходит зачастую многократно, в нашей работе исследовали эффективность инфицирования и развитие паразитов при однократном и двукратном введении личинок трематоды O. felineus мышам линии C57BL/6J. При этом планировали оценить не только степень инфицирования животных, но и их состояние по ряду физиологических показателей, поскольку известно, что кратность заражения во многих случаях коррелирует со степенью проявления патологических признаков у хозяина паразита [12].

Материал и методы

Животные. Работа выполнена на базе ЦКП «SPF-виварий» Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (ИЦиГ СО РАН). В исследовании были использованы 40 самцов мышей в возрасте 11–12 нед. Животные содержались в клетках OptiMICE (Animal Care Systems, США), оснащенных индивидуальной системой подачи чистого воздуха, на базе ЦКП «SPF-виварий» ИЦиГ СО РАН при искусственном световом режиме 10:2:12 ч (свет:сумерки:темнота), температуре воздуха 22–26°С и влажности 40–50%. Животные имели свободный доступ к воде и гранулированному корму для лабораторных грызунов SPF-категории содержания «Чара» (ЗАО Ассортимент-Агро, Россия). Поили животных деионизированной водой, полученной на установке Millipore, после обогащения минеральной добавкой «Северянка» (ООО «Эко-Проект», Санкт-Петербург). В качестве подстилочного материала применяли обеспыленные гранулы лиственных пород древесины. Корм и подстилку перед каждым использованием автоклавировали при температуре 121°С. В каждой клетке было не более 4 мышей. Все процедуры проводили в соответствии с директивами European Communities Council от 24 ноября 1986 г. (86/609/EEC), а также заключением Комиссии по биоэтике ИЦиГ СО РАН (протокол № 26 от 13 марта 2015 г.).

Получение метацеркарий O. felineus. Личинки O. felineus были получены из инфицированных язей, выловленных из реки Обь в Новосибирской области. Рыбный фарш подвергали ферментативной обработке (11 мл концентрированной HCl + 7 г пепсина на 1 л воды) и инкубировали при температуре 37°C в течение ночи с последующей фильтрацией и осаждением в 0,9% растворе хлористого натрия. Под микроскопом определяли жизнеспособность отобранных метацеркарий для дальнейшего внутрижелудочного введения животным.

Процедура эксперимента. Животные были разделены на 3 группы: 1-я – контрольные (неинфицированные) животные (n=10); 2-я – однократно инфицированные личинками гельминтов O. felineus в дозе 90 метацеркарий на каждую особь (n=12); 3-я – повторно инфицированные через 3 мес после 1-го введения личинок паразита (n=18). Введение личинок осуществляли внутрижелудочно с помощью зондов (Braintree Scientific, Inc.). Через 6 мес от начала эксперимента всех мышей умерщвляли декапитацией и производили забор крови для дальнейшего биохимического исследования. Кроме этого, определяли массу печени и селезенки, которую далее пересчитывали на 1 г массы тела. Печень с желчным пузырем помещали в физиологический раствор для подсчета в дальнейшем числа марит O. felineus, извлеченных из желчных протоков. Состояние зрелости гельминтов определяли, используя микроскоп Altami CM0745 при 10 – 40-кратном увеличении.

Биохимический анализ. Цельную кровь, собранную при декапитации животных, центрифугировали (3000 об/мин, 20 мин, при 4°С), отделяли сыворотку, которую хранили при температуре -70°С до определения активности ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ). При анализе использовали стандартные наборы реактивов (Analyticon Biotechnologies AG, Германия). Измерения выполнены на биохимическом полуавтоматическом анализаторе «Stat Fax 4500 Plus» (Awareness Technology, США).

Статистика. Все показатели оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим post hoc сравнением групп по критерию Fisher LSD, используя пакет программ Statistica 6.0. Корреляции между показателями в группах определяли непараметрическим анализом по Спирмену (Spearman rank correlation coefficient). Данные представлены как среднее ±SEM. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05 и на уровне тенденции – при 0,05 < p < 0,1.

Результаты и обсуждение

При подсчете количества гельминтов O. felineus в желчных протоках печени были установлены некоторые особенности, связанные с кратностью инфицирования животных. В обеих группах инфицированных мышей обнаружены как половозрелые мариты гельминтов с развитыми половыми органами, так и неполовозрелые, у которых визуализировались только 2 ветви кишечника, заполненные черным содержимым (рис. 1). При этом размер марит в обоих случаях варьировал. После однократного инфицирования, наряду с мелкими незрелыми маритами, были половозрелые размером около 3 мм. После двукратного инфицирования также присутствовали мелкие неполовозрелые мариты, а размер половозрелых варьировал от 1,5 до 3 мм.

Таким образом, можно предположить, при каждом последующем инфицировании мышей время созревания паразитов увеличивается. Подсчет всех гельминтов показал, через 6 мес после однократного инфицирования в печени мышей присутствовали преимущественно взрослые мариты O. felineus (рис. 2). При повторном инфицировании через 3 мес после первого число мелких неполовозрелых марит в печени мышей было больше, чем после однократного (p < 0,05), при этом несколько увеличивалось и число половозрелых. Обратную зависимость величины тела O. felineus от интенсивности заражения хозяина паразита отмечают и другие исследователи [13].

Согласно полученным данным можно заключить, что у мышей для созревания гельминтов требуется более 3 мес, причем повторное инфицирование животных увеличивает срок созревания вновь внедрившихся паразитов. Это отличает мышей от хомячков, у которых уже через 2 нед после инфицирования личинками O. felineus все мариты были половозрелыми [9]. Видимо, этим объясняется то, что при моделировании описторхоза в лабораторных условиях чаще всего используют сирийских хомячков и лишь в единичных случаях – мышей [14, 15]. Учитывая, что мыши – всеядные животные, а хомячки питаются преимущественно растительной пищей, не рыбой, которая является промежуточным хозяином для описторхид, можно предположить, что у мышей эволюционно выработались механизмы устойчивости против трематодных инфекций. Следует подчеркнуть, что выявление этих механизмов сопротивления трематодным инфекциям – не менее важная задача, чем изучение механизмов повышенной чувствительности к заражению. Оба этих направления исследования в равной степени актуальны в борьбе с описторхозной патологией у людей и животных. Возможно, устойчивость к инфекции O. felineus связана с высоким уровнем иммунной защиты у мышей. Так, по сравнению с сирийскими хомячками, у мышей C57BL/6J в крови значительно выше уровень лимфоцитов [9], главных клеток, осуществляющих контроль и иммунную защиту организма при инфекциях. Кроме того, у них почти в 2 раза больше относительная масса селезенки [9], основного органа периферической иммунной системы, в котором происходит пролиферация и дифференцировка T- и B-лимфоцитов крови. Как показали наши результаты, масса селезенки возрастает значительно на фоне инфицирования O. felineus у мышей обеих групп, причем в большей степени при двукратном инфицировании (рис. 3). При этом в обеих группах инфицированных животных относительные массы печени и селезенки коррелировали с общим число паразитов, извлеченных из печени (при однократном инфицировании: r=0,86, p=0,001 и r=0,73, p=0,011 соответственно; при двукратном инфицировании r=0,61, p=0,009 и r=0,71, p=0,001 соответственно). Учитывая то, что у мышей с двойным инфицированием снижалась масса тела и увеличивалась относительная масса печени и селезенки, можно говорить о более тяжелых последствиях повторного инфицирования личинками трематоды O. felineus у мышей C57BL/6J.

Результаты биохимических исследований подтверждают это предположение. Установлено, что у мышей после двукратного инфицирования повышается активность фермента АЛТ – главного маркера различных заболеваний печени (рис. 4). Поскольку этот показатель статистически значимо коррелировал с числом гельминтов как при однократном (r=0,81, p=0,004), так и при двукратном (r=0,66, p=0,015) инфицировании животных, можно говорить, что изменение этого показателя обусловлено развитием экспериментального описторхоза. Повышенный уровень активности другого фермента – АСТ – был обнаружен у мышей через 6 мес после однократного инфицирования, при двукратном инфицировании значение этого показателя было средним между показателем в контрольной группе мышей и у мышей с однократным инфицированием. Поскольку корреляционной связи между активностью АСТ и общим числом паразитов в печени в обоих случаях инфицирования не установлено (r=0,04, p=0,919 – при однократном и r=0,14, p=0,636 – при двукратном инфицировании), можно полагать, что АСТ в меньшей степени, чем АЛТ, отражает развитие патологического процесса. Тем более, что и в процентном отношении повышение уровня АЛТ при однократном и двукратном инфицировании было более выраженным (на 40 и 103% соответственно), чем повышение АСТ (на 25 и 11% соответственно). Фермент АЛТ находится в цитоплазме гепатоцитов, а АСТ является митохондриально-цитоплазматическим ферментом с выраженным преобладанием в митохондриях [16]. Повышение АСТ в крови свидетельствует о поражении преимущественно митохондрий, а повышение АЛТ – о более глубоких нарушениях в клетке, связанных с нарушением целостности плазматических мембран гепатоцитов. Таким образом, полученные биохимические данные свидетельствуют о более значимых нарушениях в печени у мышей на фоне двукратного инфицирования трематодой O. felineus, чем и обусловлена гибель гепатоцитов.

У людей хронический описторхоз приводит к изменению системы взаимодействий изучаемых биохимических показателей, в том числе обнаруживается значимая связь между активностью АЛТ и АСТ [17]. В нашем исследовании была получена высокая корреляционная связь между активностью 2 ферментов у мышей при двукратном инфицировании (r=0,57, p=0,041), тогда как у контрольных особей и у животных с однократным инфицированием таких значимых корреляций не обнаружено (r=-0,29, p=0,492 и r=0,20, p=0,580 соответственно). Это также свидетельствует о более выраженном развитии патологического процесса у мышей после двукратного инфицирования.

Заключение

Как показали результаты проведенного исследования, мыши линии C57BL/6J, наравне с сирийскими хомячками, являются хорошим лабораторным объектом при моделировании O. felineus-вызванного описторхоза. Через 3 мес после инфицирования в желчных протоках печени животных обнаружены половозрелые и неполовозрелые мариты паразита. Повторное инфицирование мышей спустя 3 мес после 1-го увеличивало их количество преимущественно за счет числа неполовозрелых особей O. felineus. Двойное инфицирование оказывало более выраженное негативное воздействие на организм хозяина и сопровождалось повышением активности фермента АЛТ – основного маркера воспаления в печени. Кроме того, дважды инфицированные мыши характеризовались более выраженным снижением массы тела и увеличением весового индекса печени и селезенки, что является признаками описторхоза. Считаем, что мыши линии C57BL/6J могут быть использованы для исследования механизмов развития описторхоза, а также для преклинических исследований эффективности новых антигельминтных препаратов.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант №17-04-00790) и бюджетного проекта ФИЦ ИЦиГ СО РАН (№0324-2019-0041). Исследования проведены с использованием оборудования Центра генетических ресурсов лабораторных животных ФИЦ ИЦиГ СО РАН, поддержанного Минобрнауки России (Уникальный идентификатор проекта RFMEFI62117X0015).