Сравнительное исследование использования высококалорийных диет, обогащенных разным количеством липидов, для моделирования метаболического синдрома

Введение

Метаболический синдром представляет собой многофакторный комплекс патологических изменений в организме. Поэтому выбор адекватной экспериментальной модели – основополагающий фактор при изучении патогенеза данного состояния и поиска новых лекарственных препаратов для его терапии и лечения. С целью моделирования ожирения, дислипидемии и резистентности к инсулину у лабораторных грызунов применялись различные типы диет с высоким содержанием жиров. Стандартное соотношение основных нутриентов (по калорийности от суточного рациона) для грызунов, как правило, составляет около 26% белка, 63% углеводов и 11% жира, в то время как богатая жирами диета предполагает существенное увеличение их доли в рационе – до 60% от общей суточной калорийности.

В литературных источниках приводятся убедительные данные о том, что рацион грызунов с высоким содержанием жиров животного и растительного происхождения в течение нескольких недель приводит к развитию у лабораторных животных ожирения, гипергликемии и гиперинсулинемии, гипертриглицеридемии, нарушению толерантности к глюкозе, повышению уровня холестерина и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) [1–3]. Однако результаты моделирования МС на животных с помощью диеты, обогащенной только жирами, зависят от их генотипа, пола, возраста животного, а также продолжительности воздействия диеты. Несмотря на то, что диета с высоким содержанием жиров вызывает у грызунов развитие большинства симптомов МС, характерных для человека, она существенно отличается от пищевого рациона человека, что следует учитывать при проведении доклинических исследований потенциальных препаратов для терапии МС.

Цель нашего исследования – сравнительное изучение стандартных высококалорийных диет, обогащенных разным содержанием липидов: D12451 – содержание 45% и D12492 – содержание 60% (Research Diets, Inc., США) для моделирования алиментарного метаболического синдрома на половозрелых аутбредных самцах мышей.

Материал и методы

Экспериментальное исследование выполнено на 60 половозрелых беспородных самцах лабораторных мышей. Возраст животных к началу исследования – 8 нед, масса – 25–30 г (питомник лабораторных животных НПО «Дом Фармации»), которые в период адаптации и последующего эксперимента содержались в стандартных условиях вивария. Исследование было выполнено с соблюдением принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей» (Страсбург, 1986) в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации №199н от 01.04.2016 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики»). Исследование было одобрено на заседании биоэтической комиссии НПО «Дом Фармации» № БЭК 4.21/13.

Животные были разделены на 3 группы по 20 животных в каждой: 1-я группа – интактная, животные со стандартной диетой, получали корм для содержания лабораторных животных, приготовленный по ГОСТ Р 50258-92 (массовая доля жира не более 6%); 2-я группа – животные с экспериментальным МС, получали стандартную диету D12451 (содержание жира 45%, Research Diets, Inc., США), 3-я группа – животные с экспериментальным МС, получали стандартную диету D12492 (содержание жира 60%, Research Diets, Inc., США). Длительность исследования – 21 нед.

За развитием признаков МС наблюдали еженедельно по показателям: концентрация глюкозы в периферической крови и масса тела. Для оценки возможных морфологических изменений в печени на 4–6-й и 21-й неделе осуществляли эвтаназию животных (по 5 животных из каждой группы) с целью проведения гистологического исследования. На 21-й неделе дополнительно для оставшихся животных были проведены: глюкозотолерантный тест (ГТТ), определение активности депиптидилпептидазы 4-го типа (ДПП 4) в плазме крови и концентрации холестерина и триглицеридов в сыворотке крови. Также было определено содержание гликогена в гомогенате печени.

Массу тела экспериментальных животных регистрировали на 1-й, 4-й, 8-й, 12-й, 16-й, 21-й неделе. Процедуру осуществляли на электронных весах Vibra AJ-1200CE.

Определение глюкозы выполняли экспресс-методом при помощи глюкометра OneTouch Horizоn (Lifescan, США). Осуществляли забор крови у лабораторных мышей из хвостовой вены.

Глюкозотолерантный тест проводили у лабораторных животных натощак после 4 часового голодания, доступ к воде ограничен не был. Самцы мышей получали углеводную нагрузку раствором глюкозы (ЗАО «Вектон») внутрижелудочно в дозе 3 г/кг. Концентрацию глюкозы в крови измеряли в точках 0 (фоновое значение), 30, 60, 90 и 120 мин при помощи глюкометра OneTouch Horizоn (Lifescan, США).

Концентрации холестерина и триглицеридов определяли на биохимическом анализаторе Random Access А-25 (BioSystems, Испания) с использованием реагентов фирмы BioSystems (Испания) в пробах сыворотки крови без следов гемолиза.

Измерение ДПП-4 проводили однократно на 21-й неделе исследования спектрофотометрическим методом, применяя в качестве хромагенного субстрат Gly-L-Pro p-nitroanilide [4].

В соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях от 22 сентября 2010 г. животные были эвтаназированы помещением в СО₂-камеру, в условиях постепенного заполнения камеры диоксидом углерода. В процессе некропсии проводили забор печени у каждого животного и делили ее на 2 равные части. Одну часть для гистологического исследования фиксировали в 10% растворе забуференного формалина в течение 24 ч, после чего по общепринятой методике выполняли заливку материала в парафин. Далее изготавливали гистологические срезы толщиной 5–7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологическое исследование гистологических препаратов выполнялось при помощи светооптического микроскопа Carl Zeiss (Германия). Критериями гистологической оценки служили  баллонная дистрофия, крупно- и мелкокапельный стеатоз.

Вторую часть печени использовали для оценки содержания гликогена. После извлечения фрагмент печени замораживали при температуре -20°С в течение 24 ч. Далее точные навески органа измельчали, содержание гликогена печени проводили колориметрическим методом количественного определения моно-, олиго- и полисахаридов, основанным на их способности при нагревании с серной кислотой давать производное фурфурола, которое с антроном образует окрашенное соединение. Измерение проводили на многофункциональном спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США) при длине волны 625 нм.

Результаты исследования оценивали с помощью пакета прикладных статистических программ Statistica 10.0 (StatSoft, США), и представляли их в виде среднего арифметического ± ошибка средней. Статистическую значимость различий 2 средних определяли с помощью критерия Тьюки. Нулевую статистическую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В группах самцов мышей, получавших стандартные высококалорийные диеты, с 4-й недели исследования наблюдали статистически значимое увеличение массы тела, которое сохранялось до конца эксперимента. Наибольший прирост массы тела наблюдали в группе, получавшей рацион D12492 с содержанием жира 60%. К 21-й неделе исследования масса тела животных данной группы в среднем была на 30% выше, чем в интактной группе, которая получала стандартный рацион с содержанием жира 6% (рис. 1).

При изучении в сыворотке крови концентраций холестерина и триглицеридов клинически значимых изменений в группах животных, получавших высококалорийные рационы, выявлено не было. Способность аутбредных мышей поддерживать уровень холестерина и триглицеридов даже в условиях диеты с высоким и очень высоким содержанием жиров показывает, что они не склонны к развитию атеросклеротических повреждений, которые со временем могли бы привести к повышению артериального давления [5].

Одним из важнейших критериев МС является гипергликемия, обусловленная инсулинорезистентностью. Определение концентрации глюкозы в крови самцов мышей проводили еженедельно, натощак (Начиная с 5-й недели исследования наблюдали статистически значимые отличия между интактной группой (6% жира) и группами, получавшими высококалорийные рационы (ANOVA, критерий Тьюки, p<0,05; рис. 2).

Начиная со 2-й недели исследования, в группах животных, получавших высококалорийные рационы D12451 и D12492, концентрация глюкозы в крови натощак была статистически выше, чем у животных интактной группы. Данные изменения сохранялись до конца эксперимента, и в среднем увеличение составляло 35%. Гипергликемия была выражена больше у животных, получавших D12492 с содержанием жира 60%. Устойчивое повышение концентрации глюкозы в периферической крови у животных данной группы наблюдали с 13-й недели. Тогда, как в группе животных, получавших D12451 с содержанием жира 45%, устойчивое повышение концентрации глюкозы в периферической крови наблюдали с 17-й недели. Данные изменения ожидаемы, поскольку применение рациона с большим содержанием жиров у молодых грызунов приводит к большему увеличению концентрации глюкозы в крови, что и наблюдали с 17-й недели [6].

С целью подтверждения наличия у экспериментальных животных толерантности к глюкозе на 21-й неделе исследования проводили глюкозотолерантный тест. Концентрация глюкозы в крови животных была измерена в точках 0, 30, 60, 90, 120 мин. В ходе анализа гликемических кривых установлено, что в группе животных, получавших рацион, с содержанием липидов 60% жиров (D12492). В течение 21-й недели, развивалось нарушение метаболизма глюкозы: спустя 30 мин после введения раствора глюкозы животному в дозе 3 г/кг концентрация глюкозы в крови составила свыше 15 ммоль/л, через 120 мин – превышала 11 ммоль/л (ANOVA, р>0,05). В группе животных, получавших рацион, обогащенный содержанием липидов 45% жиров, на протяжении 21-й недели толерантности к глюкозе выявлено не было.

Механизм воздействия на организм диеты, обогащенной липидами, связывают со снижением экспрессии инсулиновых рецепторов, ингибированием окисления жирных кислот, уменьшением количества переносчика ГЛЮТ4 и нарушением его транслокации в клеточную мембрану. Возможно, поэтому продолжительное 21-недельное применение высококалорийной жировой диеты в конечном итоге приводит к умеренной гипергликемии и нарушению толерантности к глюкозе у мышей [7].

Согласно данным литературы, в клинической практике развитие МС часто сопровождается повышением активности фермента ДПП-4 [8, 9]. Точный механизм данных изменений неизвестен. Со временем данные нарушения приводят к преждевременной инактивации инкретиновых гормонов, в частности глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1), что ведет к прогрессированию развития МС [10].

В нашем эксперименте у самцов мышей на 21-й неделе исследования был выполнен анализ активности ДПП-4 (табл. 1).

Статистически достоверных отличий между группами в активности ДПП-4 плазмы крови экспериментальных животных отмечено не было (ANOVA, р>0,05). Однако была выявлена тенденция к увеличению активности данного фермента в группах, получавших диеты с 45 и 60% содержанием липидов. Схожие изменения патобиохимических процессов наблюдаются и в организме человека при МС.

Накопление глюкозы в печени происходит в виде гликогена – полимеризованной формы глюкозы. Количественное определение гликогена в печени мышей было выполнено на 21-й неделе колориметрическим методом (табл. 2).

В группах животных, получавших высококалорийную диету, с содержанием липидов как 45%, так и 60%, наблюдали значительное снижение концентрации гликогена в гомогенате печени ≈ в 14 раз. Полученные данные могут быть связаны со снижением синтетической функции печени в результате пониженной активации гликогенсинтазы в результате инактивации субстрата инсулинового рецептора типов 1 и 2 (IRS-1 и IRS-2) протеинкиназой С-ε (PKC-ε). По данным литературы снижение содержания гликогена в печени является одним из основных показателей развития алиментарного МС [11].

В ходе проведенного гистологического исследования (рис. 3–7) было установлено, что микроскопическое строение печени в группе интактных животных сохранено: ткань имела упорядоченное балочное строение без признаков дистрофии и воспаления. У экспериментальных животных, получавших высококалорийный рацион, с содержанием липидов как 45, так и 60%, прослеживается последовательность возникающих изменений развития патологического процесса. У экспериментальных животных данных групп была выявлена жировая дистрофия гепатоцитов различной степени выраженности. На первых неделях исследования выявлены признаки гиалиново-капельной белковой дистрофии гепатоцитов, в дальнейшем установлено развитие мелкокапельной жировой дистрофии, при которой клетки содержали в цитоплазме мелкие жировые вакуоли, придающие им пенистый вид. К 21-й неделе исследования жировые включения увеличивались и диагносцировался выраженный крупнокапельный стеатоз, часто в сочетании с гидропической дистрофией. 

Данные изменения наиболее ярко выражены в группе животных, получавших рацион, с содержанием липидов 60%, у которых патологические изменения обнаруживались с 4-й недели и достигали максимальной выраженности к 6-й недели, сохраняясь до конца исследования. В группе животных, получавших рацион, с содержанием липидов 45% геалиново-капельную дистрофию и признаки стеатоза наблюдали лишь с 6-й недели, и только к концу исследования (21-я неделя) у некоторых животных была обнаружена мелкокапельная и редко – слабовыраженная крупнокапельная жировая дистрофия гепатоцитов. 

Полученные нами данные о структурных изменениях печени соответствуют результатам исследований R. Kobayasi и соавт. [11]. Сравнительная характеристика диет D12451 и D12492 представлена в табл. 3.

Заключение

В ходе проведенного исследования установлено, что на фоне применения высококалорийных диет, обогащенных липидами, у аутбредных 8-недельных самцов мышей развивается экспериментальная патология, характеризующаяся увеличением массы тела, умеренной гипергликемией, толерантностью к глюкозе, структурными и функциональными изменениями в печени, что нашло отражение в уменьшении накопления гликогена и в формировании крупно- и мелкокапельного стеатоза, также тенденции к увеличению активности ДПП-4. Таким образом, для формирования алиментарного метаболического синдрома у молодых самцов мышей могут быть использованы обе исследуемые диеты: D12451 – содержание жира 45% и D12492 – содержание жира 60% (Research Diets, Inc., США). На основании данных о стабильном увеличении концентрации глюкозы в периферической крови и динамике развития патологических изменений печени могут быть рекомендованы следующие сроки формирования патологии: 17 нед – на фоне применения D12451 – содержание жира 45%
и 13 нед – на фоне применения D12492 – содержание жира 60%.