Рекомендации по проведению тестирования диабетогенной активности стрептозотоцина

М.А. Ковалева(1), кандидат биологических наук, руководитель группы фармакодинамики, Е.В. Шекунова(2), кандидат биологических наук, руководитель группы экспериментальной фармакологии, В.А. Кашкин(2), кандидат медицинских наук, руководитель исследований, старший научный сотрудник, М.Н. Макарова(1), доктор медицинских наук, директор, В.Г. Макаров(2), профессор, доктор медицинских наук, директор 1-Научно-производственное объединение «Дом Фармации», 188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, 3, к. 245; 2-Институт экспериментальной фармакологии, 188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский р-н, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, д. 3, корп. 245 Е-mail: kovaleva.ma@doclinika.ru

Резюме

В настоящее время стрептозотоцин (СТЗ) является наиболее распространенным диабетогенным веществом, используемым более 50 лет для моделирования экспериментального диабета на разных видах лабораторных животных. Следует отметить, что на территории Российской Федерации отсутствуют организации, производящие субстанцию СТЗ в промышленных масштабах. Большинство российских научных центров закупают СТЗ за рубежом. Несмотря на вводимые по всему миру производственные стандарты, качество СТЗ, включая физико-химические и биологические свойства, сильно отличается в зависимости от производителя. Кроме того, следует уделять особое внимание условиям транспортировки СТЗ, в частности соблюдению температурного режима, указанного производителем. С целью обеспечения рационального проведения доклинических исследований и соблюдения принципов гуманного обращения с лабораторными животными рекомендовалось проводить биологическое тестирование каждой новой упаковки СТЗ на мелких грызунах: крысах и мышах. Биологическое тестирование СТЗ следует выполнять и для уже вскрытой упаковки, которая хранилась более 5 мес после 1-го вскрытия.

Введение

Согласно данным литературы, стрептозотоцин (СТЗ) считается одним из наиболее часто используемых диабетогенных соединений для моделирования экспериментального диабета на лабораторных животных. СТЗ представляет собой синтетический препарат – N-нитрозопроизводное глюкозамина, полученный из микроорганизмов Streptomyces achromogenes [1, 2]. СТЗ обладает токсическим действием в отношении клеток поджелудочной железы, за счет связанной в С2 положении D-глюкозы, избирательно проникающей в панкреатические β-клетки посредством переносчика ГЛЮТ-2 (GLUT-2). Панкреотоксичность СТЗ в основном связывают с алкилирующей активностью его метильной группы, что приводит к фрагментации ДНК β-клеток, в ответ на которую активируется участвующий в репарации поврежденной ДНК фермент поли-(АДФ-рибоза)-полимераза (PARP). Развивающийся в связи с этим дефицит запасов НАДH, и энергетических субстратов в виде АТФ, в конечном счете приводит к деструкции β-клеток. Данный процесс усугубляется активацией свободнорадикального окисления, связанного с генерацией пероксинитрита из избыточно образующегося оксида азота, донатором которого является нитрозогруппа СТЗ [3–5]. В многочисленных исследованиях было установлено, что на фоне введения СТЗ у лабораторных животных развиваются патологические изменения разной степени тяжести от периферической резистентности к инсулину и частичного нарушения его секреции до тотального некроза β-клеток поджелудочной железы. Проявления экспериментальной патологии во многом зависят от выбранной дозы и пути введения СТЗ, вида, линии и возраста лабораторных животных, рациона их питания и некоторых других факторов [6–8]. Поэтому исследователям целесообразнее разрабатывать собственные протоколы моделирования экспериментального СТЗ-индуцированного диабета в соответствии с поставленными целями исследования. 

Материал и методы

Лабораторные животные. Для тестирования диабетогенной активности СТЗ используют аутбредных самцов крыс или мышей с массой тела 260±20 г (10–12 нед) и 25±3 г (10–12 нед) соответственно. В период акклиматизации и проведения тестирования лабораторных животных следует содержать в стандартных условиях вивария: +19–25°C и относительной влажности воздуха 30–80%, NH3≤10 мг/м3, CO2≤0,15 об.%. Световой режим составляет 12 ч света и 12 ч темноты. Режим воздухообмена обеспечивает смену около 15 объемов помещения в 1 ч.
Для кормления используется стандартная диета для лабораторных грызунов.

Подготовка СТЗ к введению. На сегодняшний день не существует установленного протокола для подготовки раствора СТЗ для введения. В большинстве опубликованных материалов сообщается об использовании способа, аналогичного, описанному в 1960-х годах [1]. В публикациях тех лет подчеркивалось, что для обеспечения стабильности СТЗ в растворе требуется создание низкой рН. В более поздних работах также представлена информация об использовании буферного раствора с рН 4,0–4,5 для растворения СТЗ [9, 10]. Также имеются данные о стабильности растворов СТЗ при рН 7,2 и рН 7,4 при температуре 37°C, СТЗ стабилен в данных растворах около 1 ч [11, 12]. В некоторых лабораториях готовый раствор СТЗ располагают на льду с целью дополнительного обеспечения его стабильности [13]. Необходимо учитывать, что препараты СТЗ, используемые для доклинических исследований, сегодня имеют качественные характеристики, отличные от тех, которые были характерны для субстанций, синтезированных в 60–80-х годах прошлого века, что может объяснять разную биологическую активность [14].

В нашей лаборатории исследования с использованием модели СТЗ-индуцированного диабета проводятся более 10 лет. За это время выявлены такие критические точки данной экспериментальной модели, как статус здоровья животных, диабетогенная активность, выбор дозы СТЗ для формирования патологии в основном исследовании. На основании этих данных был разработан протокол биологического тестирования СТЗ.

Протокол тестирования диабетогенной активности СТЗ

Тестирование выполняют на крысах в тех случаях, когда основное исследование запланировано на любом виде животных, кроме мышей. Мышей используют, если запланировано основное исследование на этом виде животных, поскольку для данного вида животных необходимы бóльшие дозы СТЗ, чем для крыс. Для проведения тестирования формируют группу из 5 животных. При выполнении тестирования следует обратить внимание на условия содержания животных, которые должны соответствовать условиям содержания животных в планируемом эксперименте. Это критический фактор, поскольку, по нашим наблюдениям, деабетогенное действие СТЗ наиболее выражено у животных, содержащихся в группе по сравнению с животными, которые содержатся, изолированно (результаты не опубликованы).

Перед введением СТЗ животных лишают корма, крыс – на 16 ч, мышей – на 6 ч, при этом доступ к воде не ограничен. Далее животных взвешивают, готовят раствор СТЗ в цитратном буфере рН=4,5–5,5. Для приготовления цитратного буфера совместно используют растворы 10 мМ цитрата натрия и 10 мМ лимонной кис-лоты. После растворения СТЗ визуально оценивают отсутствие осадка, емкость с раствором помещают на лед и накрывают непрозрачным материалом для исключения попадания прямых солнечных лучей. Раствор СТЗ следует вводить животным не позднее 30 мин с момента его приготовления. СТЗ вводят 1-кратно крысам в дозе 65 мг/кг, мышам – 100 мг/кг.

Концентрацию глюкозы измеряют натощак экспресс-методом с помощью глюкометра, например, One Touch Ultra Easy («Джонсон & Джонсон») ежедневно на протяжении 4 дней. Время голодания перед измерением уровня глюкозы для мышей составляет 4 ч, для крыс – 6 ч. Первое измерение выполняют спустя 24 ч после инъекции СТЗ [15]. Через 48 ч после инъекции СТЗ у грызунов возможно развитие гипогликемии, которая может стать причиной гибели животных. Если в ходе тестирования у одного животного концентрация глюкозы в периферической крови ниже 2,8 ммоль/л в течение 48 ч при этом общая двигательная активность снижается, необходимо рассмотреть вопрос о гуманном выведении животного из исследования. Если гипогликемия наблюдается у бóльшего числа животных, то в клетку содержания на 1 сут дополнительно к поилке с водой следует поместить поилку с 15% раствором глюкозы. При значительном ухудшении общего состояния животных допускается внутрибрюшинное введение 10% раствора глюкозы в объеме 1,5 мл мышам и 3 мл крысам.

СТЗ считается биологически активным, если концентрация глюкозы (натощак) на 5-й день после введения СТЗ у 4 из 5 крыс превышает 7,5 ммоль/л, у мышей – 12,0 ммоль/л. 

При введении более низких доз СТЗ, при необходимости индуцировать диабет более близкий по основным проявлениям к сахарному диабету 2-го типа, может наблюдаться отсутствие значимого повышения глюкозы в крови. Однако это не свидетельствует об отсутствии активности СТЗ. В таких случаях целесообразно провести гистологическое исследование ткани поджелудочной железы, с целью убедиться, что данная доза СТЗ индуцирует патологические изменения. Целесообразность проведения такого гистологического исследования определяется целями основного эксперимента. Также для подтверждения развития экспериментального диабета при отсутствии значимых изменений фонового уровня глюкозы крови натощак, возможно проведение глюкозотолерантного теста (ГТТ). В нашей лаборатории ГТТ проводят в соответствии с методикой, Е. Juliо (2010). Для этого измеряют концентрацию глюкозы у животных натощак (фон), после чего однократно внутрижелудочно вводят глюкозу в дозе 2 г/кг. Спустя 30, 60, 90 и 120 мин после введения у животных определяют концентрацию глюкозы в крови. В табл. 2 приведены ориентировочные диапазоны уровней глюкозы по результатам ГТТ.

Как видно из данных табл. 2, на фоне введения СТЗ в дозе 65 мг/кг уровень глюкозы в крови экспериментальных животных выраженно увеличивается с 30-й минуты после введения глюкозы, и сохраняется на высоком уровне вплоть до 120-й минуты.

Заключение

Проведение тестирования биологической активности СТЗ перед моделированием экспериментального диабета в основном исследовании является залогом соблюдения принципов 3Rs. При неожиданных результатах – полном отсутствии или низкой биологической активности стрептозотоцина – можно своевременно принять корректирующие действия и выбрать оптимальную дозу индуктора патологии для проведения доклинического исследовании, предотвратить нецелесообразное использование животных в эксперименте.

Список литературы

  1. Rakieten N., Rakieten M.L., Nadkarni M.V. Studies on the diabetogenic action of streptozotocin (NSC-37917). Cancer Chemother Rep. 1963. 29: 91–8.
  2. Kishore L., Kajal A., Kaur N. Role of Nicotinamide in Streptozotocin Induced Diabetes in Animal Models. JETR. 2017. Vol. 2(1): 001-004. DOI: 10.19080/JETR.2017.02.555577.
  3. Ghasemi A., Khalifi S., Jedi S. Streptozotocin-nicotinamide-induced rat model of type 2 diabetes (Review). Acta Physiologica Hungarica. 2014. Vol. 101 (4): 408–20. DOI:10.1556/APhysiol.101.2014.4.2.
  4. Piepper A.A., Verma A., Zhang J., Snyder S.H. Poly (ADP-ribose) polymerase, nitric oxide and cell death. Trends in Pharmacological Sciences. 1999. Vol. 20: 171–81.
  5. Okamoto H. Okamoto model for B-cell damage: Recent advances. Lessons from animal diabetes. 1996: 97–111.
  6. Etuk E.U. Animal models for studying diabetes mellitus. Agric Biol J N Am. 2010. Vol. 1 (2): 130–4.
  7. Hayashi K., Kojima R., Ito M. Strain differences in the diabetogenic activity of streptozotocin in mice. Biol Pharm Bull. 2006. Vol. 29 (6): 1110–9.
  8. Bonner-Weir S., Trent D.F., Honey R.N., Weir G.C. Responses of neonatal rat islets to streptozotocin: limited B-cell regeneration and hyperglycemia. Diabetes. 1981. Vol. 30 (1): 64–9.
  9. Gurley S.B., Clare S.E., Snow K.P., Hu A., Meyer T.W., Coffman T.M. Impact of genetic background on nephropathy in diabetic mice. American journal of physiology. 2006. Vol. 290 (1): F214–F222. DOI:10.1152/ajprenal.00204.2005.
  10. Dekel Y., Glucksam Y., Elron-Gross I., Margalit R. Insights into modeling streptozotocin-induced diabetes in ICR mice. Lab animal. 2009. Vol. 38 (2): 55–60. DOI:10.1038/laban0209-55.
  11. Axler D.A. Stability of the diabetogenic activity of streptozotocin. IRCS Medical Science. 1982. Vol. 10: 157–8.
  12. Lenzen S. The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes. Diabetologia. 2008. Vol. 51 (2): 216–26. DOI: 10.1007/s00125-007-0886-7.
  13. Ninova D., Dean P.G., Deeds M., Stegall M.D. A novel model of allograft rejection: immune reconstitution of Rag-1 recipients with 2C transgenic T-cell receptor lymphocytes // Transplant International. 2005. Vol. 18 (1): 101–10. DOI:10.1111/j.1432-2277.2004.00012.x.
  14. Junod A., Lambert A.E., Orci L., Pictet R., Gonet A.E., Renold A.E. Studies of the diabetogenic action of streptozotocin. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine Society for Experimental Biology and Medicine. 1967. Vol. 126 (1): 201–5.
  15. West E. Simon O.R., Morrison E.Y. Streptozotocin alters pancreatic beta-cell responsiveness to glucose within six hours of injection into rats. West Indian Med J. – 1996. Vol. 45: 60–2.
  16. Julio E. Ayala Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mic. Disease Models & Mechanisms. – 2010: 1–10.

Вас может заинтересовать