Патоморфологическая диагностика легких при различных методах эвтаназии лабораторных животных

Е.В. Беляева(1), научный сотрудник, А.В. Рыбакова(1), старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук, Я.А. Гущин(1), научный сотрудник, Д.С. Ваганова(1), научный сотрудник, К.Е.Коптяева(1), научный сотрудник, А.А. Мужикян(1), старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук, М.Н. Макарова(1), доктор медицинских наук, В.Г. Макаров(2), доктор медицинских наук, профессор 1-Научно-производственное объединение «Дом Фармации», 188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, ул. Заводская, 3, к. 245; 2-Санкт-Петербургский институт фармации, 188663, Россия, Ленинградская обл., Всеволожский район, г.п. Кузьмоловский, к. 245 Е-mail: belyaeva.ev@doclinika.ru

Резюме

Известно, что углекислый газ и анестетики, применяемые для эвтаназии лабораторных животных, могут приводить к появлению артефактов, наличие которых приводит к противоречивым результатам при патоморфологической диагностике. Особенно часто выбранный метод эвтаназии влияет на структуру органов дыхательной системы, главным образом на легкие. Цель данного исследования – выявление патоморфологических изменений в органах дыхания, связанных с использованием наиболее распространенных способов эвтаназии. Исследование проводили на самцах и самках крыс, мышей, хорьков и кроликов. Для всех видов животных использовали различные дозы и концентрации углекислого газа, а также ветеринарные препараты Ветофол и комбинацию Золетил и Ксила при внутривенном и внутрибрюшинном путях введения. После констатации смерти животных извлекали легкие с последующей фиксацией их в 10% формалине, вырезкой, стандартной гистологической проводкой, изготовлением срезов и окраской гематоксилин-эозином. При любом методе эвтаназии были обнаружены макроскопические и гистологические признаки отека, ателектаза и эмфиземы легких, участки геморрагий, которые в разной степени выраженности встречались у всех исследованных животных. На степень проявления обнаруженных изменений большое влияние оказывал способ введения препаратов. Наименее выраженные патологические изменения в органах дыхательной системы были выявлены при внутривенном введении комбинации препаратов Золетил и Ксила, в то время как при внутрибрюшинном введении тех же препаратов изменения были максимальными. Полученные результаты позволяют предложить практические рекомендации по методике выбора способа эвтаназии и дозировке препаратов при выполнении патоморфологической диагностики органов дыхания лабораторных животных при проведении доклинических исследований.

Введение

Патоморфологическое исследование органов дыхания широко используется при определении токсичности лекарственных препаратов на стадии доклинических исследований [5, 27]. Проведению патологоанатомического и гистологического исследований предшествует эвтаназия животных. Эвтаназия (от греческого eu – хорошо, thanatos – смерть) – это процесс безболезненного умерщвления животного [1, 8]. В последнее время во всем мире уделяется большое внимание гуманности проведения тех или иных манипуляций с животными. Особое значение имеет метод эвтаназии, используемый для лабораторного животного. Выбор метода эвтаназии должен соответствовать гуманным принципам, а также позволять провести объективную оценку влияния исследуемого препарата на организм лабораторного животного [8]. С точки зрения этических принципов следует выбрать надежный, легко выполнимый и необратимый метод эвтаназии, т.е. такой, который гарантирует быструю потерю сознания, а в дальнейшем приводит к остановке сердца, дыхания и окончательной потери функции мозга [1–3, 6, 8, 24]. 

Существуют 3 группы методов эвтаназии: агенты, оказывающие прямое угнетение функциональных нейронов; агенты, вызывающие стойкую гипоксию; агенты, вызывающие разрушение структур головного мозга [1, 6, 8]. Любой из них приводит к различным изменениям в клетках, тканях и органах, а также влияет на весь организм в целом. Это следует учитывать при дальнейшей патоморфологической диагностике, так как изменения, возникшие в результате эвтаназии, могут быть ошибочно приняты за результат действия исследуемого препарата на организм животного. 

Цель данной работы – апробация известных методов эвтаназии лабораторных животных с точки зрения влияния их на патологоанатомическую и гистологическую картину легких.

Материал и методы

Исследование проводилось на самцах и самках аутбредных крыс (n=20), мышей (n=40), новозеландских кроликов (n=10) и хорьков (n=10), взятых из питомника НПО «Дом Фармации»». Масса крыс составляла 250–300 г, мышей – 20–30 г, кроликов – 3,6–4,2 кг, хорьков – 2,5–3 кг. 

Животные содержались в стандартных условиях вивария, потребляли полнорационный гранулированный комбикорм, доступ к воде был не ограничен. Эвтаназия осуществлялась в рамках проводимых в Организации исследований, в соответствии с планами исследований. Отдельно с целью выполнения данной работы животные не эвтаназировались. 

Для проведения исследования применялись ветеринарные препараты, зарегистрированные на территории Российской Федерации и разрешенные для использования в ветеринарии (табл. 1), а также углекислый газ (СО2).

Дозы препаратов для эвтаназии разных видов животных (табл. 2) были выбраны на основании данных литературы [15–17, 20, 21, 26].

После эвтаназии и наступления смерти животных осуществляли патологоанатомическое исследование и эвисцерацию органов дыхательной системы (трахея и легкие) с последующей фиксацией материала в 10% растворе нейтрального забуференного формалина в течение 24 ч. 

Для дальнейшего гистологического исследования по общепринятой методике отобранный материал подвергался вырезке, стандартной проводке, заливке в парафин. Затем изготавливали срезы толщиной 5–7 мкм, которые окрашивались гематоксилином и эозином [4]. На этапе вырезки производили отбор материала от каждой доли легких у крыс, хорьков и кроликов. У мышей легкие помещались в кассету целиком [14]. Анализ гистологических препаратов выполняли при помощи светооптического микроскопа Carl Zeiss Axio Scope A1 (Германия) при увеличении 50, 100, 200 и 400. Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры AxioCam ICc 1 и программного обеспечения AxioVision Rel. 4.8 (Германия).

Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения Statistica 6.0 (SoftStat, США), где рассчитывались медиана и квартильный размах, поскольку данные не соответствовали нормальному закону распределения.

Результаты и обсуждение

У всех исследованных животных выявлены патологические изменения в ткани легких, связанные с эвтаназией (табл. 3).

При применении углекислого газа с заданной скоростью потока визуально отмечались отек легких и мелкоточечные геморрагии (рис. 1–4). При гистологическом исследовании также было подтверждено наличие отека легких с неравномерными участками ателектазов и кровоизлияний. При этом у крыс изменения были выражены сильнее, чем у мышей, и проявлялись в виде дистелектазов, причем вместе с участками спадения альвеол присутствовали расширенные участки (см. рис. 2–4).

Внутривенное (в/в) введение препаратов Золетил и Ксила вызывало незначительные изменения в легких животных, за исключением таковых у мышей (рис. 5–8). Отек легких был не выражен и отмечался только у кроликов, так же как и эмфизема (рис. 9–10). Единичные геморрагии наблюдались у хорьков. У всех животных наблюдались небольшие участки спадения легочной ткани (рис. 11–12). У мышей патологические изменения были умеренно выражены и носили диффузный характер.

При внутрибрюшинном (в/б) введении препаратов картина передозировки была выражена ярче, чем при внутривенном пути введения. У крыс присутствовали мелкие кровоизлияния и очаговые ателектазы, чередующиеся с очагами расширения альвеолярной ткани (рис. 13–14). В то же время у мышей вместо ателектазов микроскопически определялись обширные участки эмфизематозно расширенных альвеол с разрывами межальвеолярных перегородок и множественные кровоизлияния, при этом макроскопически эмфизема была умеренно выражена
(рис. 15–16).

Ветофол при внутривенном введении не вызывал отек легких. Макроскопически у крыс и хорьков изменения отсутствовали, у мышей и кроликов отмечались геморрагии различной величины (рис. 17–24). При микроскопическом исследовании отмечались участки расширения альвеолярной ткани и очаговые дистелектазы, которые у мышей и кроликов сопровождались кровоизлияниями в ткани легких (см. рис. 18, 20, 22, 24).

Согласно полученным данным и результатам исследований многих авторов, метод эвтаназии оказывает значительное влияние на структуру легких [1]. Так, в ряде исследований при использовании CO2 в различных концентрациях для эвтаназии крыс и мышей при патоморфологическом исследовании отмечались кровоизлияния в ткани легких и отек легких (Dannemanetal, 1997); кровоизлияния, отек легких и эмфизема (Iwarsson&Rehbinder, 1993). J.K. Fawell et al. (1972) обнаружили отек периваскулярной соединительной ткани в легких крыс [10, 11, 13]. Существующие результаты исследований зависимости концентрации CO2 и степени выраженности изменений отличаются. Так, Britt (1986) в своих исследованиях выявил выраженные кровоизлияния в ткани легких при более высоких концентрациях CO2. В свою очередь, Danneman (1997) обнаружил, что степень кровоизлияний и отека легких отрицательно коррелирует с концентрацией вдыхаемого CO2, однако это может быть результатом увеличенного времени экспозиции, в результате чего животные подвергаются воздействию газа в течение длительного времени [9–11, 18]. 

В других исследованиях выявлено, что при медленной эвтаназии в ткани легких определялся сильно выраженный отек, при этом альвеолы находились в состоянии выраженного ателектаза, а в межальвеолярных перегородках встречались микрокровоизлияния. В случае быстрой эвтаназии с высокой концентрацией CO2 массивного ателектаза легких не наблюдается, однако присутствуют дистелектаз, т.е. чередование участков ателектазов, и эмфизематозное расширение альвеол с разрывом межальвеолярных перегородок. Также присутствует интерстициальный отек легких с обширными кровоизлияниями [1, 25].

При использовании CO2 для эвтаназии у мышей отмечаются назальное и легочное кровотечения, развитие и распространенность которых не зависят от возраста, пола и физиологического состояния животного. При этом легочное кровотечение не ограничивается одной легочной долей, а наблюдается во всех долях. Назальное кровотечение всегда ограничивается просветом полости носа, при этом на слизистой оболочке носовой полости отсутствуют повреждения и кровоизлияния. Это наблюдение может указывать на то, что легочное кровотечение развивается раньше, чем назальное, а кровь выходит из легкого в носовую полость. Указанные наблюдения опровергают тот факт, что раздражение и повреждение слизистой оболочки носа от высоких концентраций CO2 приводят к назальному кровотечению. Кроме того, при гистологическом исследовании в очагах назального и легочного кровотечения отсутствует воспалительная инфильтрация. Таким образом, развитие геморрагических поражений в легких наиболее вероятно связано с использованием газа, однако сам механизм его развития неясен [18]. 

У мышей, которых эвтаназировали CO2 с предварительным использованием изофлурана, не обнаруживали патологических изменений в легких [23].

Результаты наших исследований с использованием углекислого газа согласуются с приведенными данным литературы [1, 10, 11, 13, 25]. При макроскопическом исследовании отмечали отек легких и участки геморрагий, более выраженные у крыс. При гистологической диагностике у крыс и мышей подтверждали диагнозы, установленные при визуальном осмотре исследованных органов, а также обнаруживали участки ателектаза и эмфиземы, однако эмфизема не сопровождалась разрывом межальвеолярных перегородок. В других органах дыхательной системы не было выявлено патологических изменений, связанных с методом эвтаназии.

Наиболее гуманным методом эвтаназии для лабораторных животных является передозировка средствами для наркоза. Для этого вводится анестезирующее средство в дозе, которая превышает в 3 раза дозу, обеспечивающую общий наркоз. В случае введения летальной дозы животное засыпает, далее отмечается остановка сердца и дыхания. Несмотря на то, что при данном виде эвтаназии животное погибает быстро, анестетик может вызвать эффекты, которые сохраняются в тканях после прекращения циркуляции крови, тем самым влияя на патоморфологическую картину тканей и органов [19]. 

В литературе нет данных о патоморфологических изменениях при применении препаратов Золетил и (или) Ксила для эвтаназии лабораторных животных. Однако исследователями отмечено, что при использовании сочетания Ксилазина и Кетамина у крыс выявляется макроскопически выраженный серозный плеврит, сопровождаемый гидротораксом, а также отек легких с серо-красными геморрагиями. Гистологическим исследованием при этом выявляются альвеолярные и периваскулярные отеки, иногда локализованные только в области ворот органа [7]. 

Для эвтаназии животных мы применяли комбинацию препаратов Золетил и Ксила, которую вводили внутривенно и внутрибрюшинно. Макроскопически не обнаруживали признаков серозного плеврита и гидроторакса, как отмечалось в литературных источниках, однако были выявлены отек легких и геморрагии у мышей и хорьков при внутривенном введении препаратов. При гистологическом исследовании самые яркие изменения в легких были выявлены у мышей (отек и участки ателектаза), у кроликов – слабовыраженные признаки отека, ателектаза и эмфиземы легких. Наиболее выраженные изменения в легких отмечались при внутрибрюшинном введении комбинации препаратов Золетил и Ксила крысам и мышам. При этом признаки эмфиземы легких и участки геморрагий встречались у мышей, в то время как у крыс геморрагии были менее выраженные, а наряду с эмфиземой выявлялись участки ателектаза. В других органах дыхательной системы, как и при использовании СО2, патологические изменения отсутствовали.

Значительные изменения в легких обнаруживаются при изучении влияния препарата Ветофол на организм кроликов. Так, при макроскопической оценке органа отмечается его увеличение, кровоизлияния и отек, который сопровождается скоплением розоватой пенистой жидкости в верхних дыхательных путях, а также в просвете трахеи и бронхов. При дальнейшем гистологическом исследовании выявляется интерстициальная пневмония и отек. Альвеолы при этом заполнены альвеолярными макрофагами, а альвеолярный эпителий находится в состоянии гиперплазии [22]. Результаты гистологических исследований влияния препарата Ветофол на структуру легких крыс показывают наличие дилатации дыхательных путей [12]. 

Полученные нами результаты действия препарата Ветофол на органы дыхательной системы не согласуются с данными литературы. При использовании препарата Ветофол для эвтаназии внутривенно у кроликов отмечались участки ателектаза, эмфиземы и геморрагии. Макроскопические и гистологические признаки отека и интерстициальной пневмонии отсутствовали, гиперплазия альвеолярного эпителия в наших исследованиях не подтвердилась. У крыс и хорьков отмечали ателектаз и эмфизему легких, последняя была более выражена у крыс, дилатация дыхательных путей не обнаружена. У мышей наблюдались наиболее выраженные геморрагии в ткани легких, а так же, как и у других исследуемых животных, – участки ателектаза и эмфиземы. 

Заключение

Согласно полученным данным, при использовании любого исследованного нами метода эвтаназии будут отмечаться патологические изменения в органах дыхания, главным образом в легких. Большое влияние на появление этих изменений также оказывает способ введения препаратов. Самые выраженные изменения в легких отмечались при внутрибрюшинном введении комбинации препаратов Золетил и Ксила, что, вероятно, связано с очень большой всасывающей поверхностью брюшины, которая обеспечивает быстрое всасывание лекарственных средств и жидкостей. Менее выраженными, но не менее значительными, оказались изменения при внутривенных введениях исследуемых анестетиков. Основные патологические изменения при использовании препарата Ветофол, а также комбинации препаратов Золетил и Ксила, проявляются в виде ателектаза, эмфиземы и геморрагий в ткани легких, в то время как отек легких практически не встречался. При использовании углекислого газа для эвтаназии у грызунов характерными признаками являются отек и геморрагии в ткани легких, при этом ателектаз и эмфизема встречаются реже.

Полученные результаты можно использовать при проведении эвтаназии лабораторных животных с целью дальнейшего патоморфологического исследования органов дыхания, а также в спорных случаях о причинах возникновения тех или иных патологических изменений в исследованных органах.

Список литературы

  1. Гущин Я.А., Мужикян А.А. Влияние методов эвтаназии на гистологическую картину легких мелких грызунов. Международный вестник ветеринарии. 2014; 4: 96–104.
  2. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях. Гл. I, ст. 6.
  3. Европейская конвенция по защите домашних животных № 125 от 13.11.87 г. Гл. II, ст. 11.
  4. Мужикян А.А., Макарова М.Н., Гущин Я.А. Особенности гистологической обработки органов и тканей лабораторных животных. Международный вестник ветеринарии. 2014; 2: 103–9.
  5. Мужикян А.А., Макарова М.Н., Гущин Я.А. Особенности патологоанатомического исследования группы экспериментальных животных. Международный вестник ветеринарии. 2014; 2: 103–9.
  6. Рыбакова А.В., Макарова М.Н. Методы эвтаназии лабораторных животных в соответствии с европейской директивой 2010/63. Международный вестник ветеринарии. 2015; 2: 96–107.
  7. Anesthetic and pathological changes following highdoses of ketamine and xylazine in Sprague Dawleyrats / M.C. Giroux, P. Hélie, P. Burns, P. Vachon. Experimental animals. 2015; 64 (3): 253–60.
  8. AVMA. Euthanasia of animals that are unwanted or unfit for adoption. Available at: www.avma.org/KB/Policies/Pages/ Euthanasia of-Animals-That-Are-Unwanted-or-Unfit-for-Adoption.aspx. Accessed May 7, 2011.
  9. CCAC guidelines on: euthanasia of animals used in science. R. Charbonneau, L. Niel, E. Olfert et al. Canadian Council on Animal Care. 2010; 32.
  10. Comparison of Carbon Dioxide and Argon Euthanasia: Effects on Behavior, Heart Rate, and Respiratory Lesions in Rats. T.H. Burkholder, L. Niel, J. L. Weed et al. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 2010; 49 (4): 448–53.
  11. Conlee K.M. Carbon dioxide for euthanasia: concerns regarding pain and distress, with special reference to mice and rats/ K.M. Conlee, M.L. Stephens, A.N. Rowan. Laboratory Animals. 2005; 39 (2): 137–61.
  12. Effects of propofol on respiratory mechanic and lung histology in normal rats. A. Peratoner, C.S. Nascimento, M.C.E. Santana et al. Zin. British Journal of Anaesthesia. 2004; 92 (5): 737–40.
  13. Fawell J.K., Tomson C., Cooke L. Respiratory artifact produced by carbon dioxide and pentobarbitone sodium euthanasia in rats. Laboratory Animals. 1972; 6: 321–6.
  14. Guidance document on histopathology for inhalation toxicity studies, supporting TG 412 (subacute inhalation toxicity: 28-day study) and TG 413 (subchronic inhalation toxicity: 90-day stude). OECD Environment, Health and Safety Publications, №125. Paris, 2010: 52.
  15. Guide for the care and use of laboratory animals. National Academy press. Washington, D.C. 1996.
  16. Guidelines for anesthesia and analgesia in laboratory animals. Animal Care and Use Program. University of California, Berkeley. 2012; 5.
  17. Guidelines for rodent and rabbit anesthesia, analgesia and tranquilization and euthanasia methods. Tulane University IACUC. 2012; 6.
  18. Interstrain Differences in CO2-Induced Pulmonary Hemorrhage in Mice. S. Fisher, W.L. Burgess, K.D. Hines et al. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 2016; 55 (6): 811–5.
  19. Karmarkar S.W., Bottum K.M., Tischkau S.A. Considerations for the Use of Anesthetics in Neurotoxicity Studies/ Comparative Medicine. 2010; 60 (4): 256–62.
  20. Keeble E., Meredith А. BSAVA Manual of Rodents and Ferrets. BSAVA. 2013; 391.
  21. Matchett A., Marr R., Berard F. et al. The laboratory ferret. CRC Press. 2012; 114.
  22. Organ Toxicity and Mortality in Propofol-Sedated Rabbits Under Prolonged Mechanical Ventilation. P. Ypsilantis, M. Politou, D. Mikroulis et al. Anesthesia & Analgesia. 2007; 105 (1): 155–66.
  23. Physiological, Behavioral, and Histological Responses of Male C57BL/6N Mice to Different CO2 Chamber Replacement Rates. G.P. Boivin, M.A. Bottomley, E.S. Dudley et al. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 2016; 55 (4): 451–61.
  24. Recognition and Alleviation of Pain and Distress in Laboratory Animals. National Academies Press. Washington, D.C. 1992; 160.
  25. Report of the ACLAM Task Force on Rodent Euthanasia. J. Artwohl, P. Brown, B. Corning, S.Stein. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 2006; 45 (1): 98–105.
  26. Suckow M., Stevens K., Wilson R. The laboratory rabbit, guinea pig, hamster and other rodent. Academic Press. 2012; 1268.
  27. Weber K. Role of the Study Pathologist. Toxicologic Pathology. 2014; 42 (1): 276–77.

Вас может заинтересовать