Особенности отбора бронхоальвеолярного лаважа у лабораторных животных

Введение

Получение бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) (смыва) – это процедура, используемая для изучения клеточного и внеклеточного содержимого пространства легких [1, 2].

Исследование БАЛЖ с помощью цитологических и иммунологических методов позволяет установить определенные изменения жизнеспособности клеток, их функциональной активности и соотношений между отдельными клеточными элементами, что дает возможность судить об этиологии и активности патологического процесса в легких. При заболеваниях, характеризующихся образованием специфических клеток и телец, информативность цитологического исследования бронхоальвеолярных смывов может быть приравнена к информативности биопсии. При микробиологическом исследовании бронхоальвеолярных смывов могут быть выявлены возбудители туберкулеза, пневмоцистоза и другие. При биохимическом исследовании могут быть оценены содержание белков, липидов, диспропорции в соотношении их фракций, нарушения в активности ферментов и их ингибиторов, биологически активные соединения. Особенно информативно комплексное применение перечисленных методов исследования бронхоальвеолярных смывов [3].

БАЛЖ содержит секрет, покрывающий апикальные поверхности бронхиального и альвеолярного эпителия. На объем аспирированной жидкости и клеточные и неклеточные компоненты БАЛЖ влияют многие факторы. Вследствие этого для получения информативного материала важное значение имеет методика выполнения забора, обработка и анализ БАЛЖ [4].

Основные принципы и особенности забора бронхоальвеолярного лаважа

Целью данной манипуляции является взятие БАЛЖ, в котором содержатся образцы жидкости эпителиальной выстилки легких и нижних дыхательных путей животного. Вне зависимости от цели забора БАЛЖ и вида животного методика базируется на введении инструмента в определенный участок трахеи, промывке легких (или сегмента легкого) определенным изотоническим раствором, в результате чего собирается БАЛЖ, для дальнейшего анализа на содержание в нем определенных компонентов.

Как было указано ранее, особенности забора БАЛЖ зависят от вида животного и цели проведения манипуляции. Процедура забора БАЛЖ может быть как терминальной, так и не терминальной (забор БАЛЖ прижизненный). Обычно для мелких грызунов (крысы, мыши и морские свинки) данную манипуляцию проводят терминально, для хомяков и крупных млекопитающих животных процедура может быть проведена прижизненно для оценки динамики каких-либо патологий и эффективности терапии [5]. Чаще всего процедуру забора БАЛЖ проводят на анестезированных животных. Общую анестезию животного обеспечивают с помощью введения анестезирующих препаратов таких, как хлоральгидрат [6, 7], трибромэтанол (или авертин) [8], уритан [9], пентобарбитал натрия [10, 11], золетил [12], изофлюран [13], диазепам, кетамин, смесь ксилазина и кетамина [14] и галотан [5]. При необходимости животное эвтаназируют с помощью передозировки этилкарбаматом [15], пентобарбиталом натрия [14, 16–18], смеси кетамина и ксилазина [19] и золетилом [20], а так же обескровливания [6, 7, 10, 12, 16] и цервикалной дислокацией [1]. Согласно работе R.F. Henderson (2005), применение диоксида углерода для начального этапа эвтаназии не является подходящим, так как данный газ оказывает влияние на состав БАЛ. Однако встречаются работы с применением данного метода [21, 22].

Существует два способа получения БАЛ, которые зависят от места введения инструмента (катетер, шприц с тупой иглой): открытый и закрытый. Открытый способ приемлем для наркотизированных животных, подлежащих эвтаназии, или уже эвтаназированных животных, так как для этого способа необходимо вскрывать грудную клетку для обеспечения доступа к легким. В большинстве случаев открытый способ используют для промывки отдельного сегмента легкого у крупных животных и полностью одного легкого с лигированием второго у мелких грызунов. Одной из разновидностей забора БАЛ открытым способом является промывка легких после их извлечения. Для этого комплекс сердце–легкие аккуратно извлекают, и далее промывают легкое (или легкие) шприцом с тупой иглой через трахею [1, 23, 24] (рис. 1, 2).

Забор БАЛ при закрытом способе удобен при исследовании динамики протекания болезни или лечения животных [13]. При закрытом типе чаще всего проводят забор БАЛ непосредственно через трахею, выделенную в области шеи [7, 25], либо с помощью трубки для интубации [13] или эндоскопа [26] без вскрытия грудной клетки (рис. 3).

Данный способ забора БАЛ не позволит проводить промывку отдельного сегмента легкого или одного легкого.

Для забора БАЛ в качестве жидкости для промывания легких используют изотонические растворы: физиологический раствор [10, 12, 13, 20, 25, 27], сбалансированные солевые растворы (фосфатно-солевой раствор (PBS) [6-9, 15–19, 21, 22, 24, 28–31], буфер Хэнкса [32], растворы, свободные от кислорода (OFS) [11]) или 0,5% раствором глюкозы [33]. Такие растворы помогают избежать повреждения клеток и тканей легких при процедуре забора БАЛ, а OFS используют для минимизации дальнейшего окисления тканей легких. Важным аспектом является отсутствие или наличие в омывающей жидкости катионов кальция и магния, которые необходимы для прилипания макрофагов к поверхности эпителия легких. Решение включить эти катионы или нет, будет зависеть от цели исследования, поскольку наличие данных катионов в жидкости приводит к сбору только свободных и неприкрепленных клеток в альвеолах, исключая макрофагов. Если целью является изучение полного клеточного состава, следует использовать омывающую жидкость без катионов кальция и магния. Также при планировании оценки в БАЛ тех или иных биологически активных веществ необходимо учитывать возможное влияние на их определение используемых растворов.

Для того чтобы избежать повреждения тканей легкого, в результате введения омывающей жидкости, необходимо подобрать объем для определенного животного. В работах R.F. Henderson (2005) описано, что такой объем можно рассчитать на основе 80% изменения объема легких при давлении 20 см вод. ст. или 80% общей емкости легких, рассчитанной на основе массы тела по уравнению Шталя, или в 5 раз больше объема ткани легкого. В таблице представлены использованные объемы омывающей жидкости для забора БАЛ разных видов животных.

Объемы омывающей жидкости для однократного введения в легкие животных различных видов

Для большинства токсикологических исследований целесообразно использовать наименьшее количество повторных промываний для получения БАЛЖ. Большое количество промывок может привести к разбавлению компонентов БАЛЖ, которые необходимо изучить. В работе F. Rogene Henderson (2005) доказано, что 75% от общего количества компонентов БАЛ извлекается при первых двух промывках. В большинстве случаев при процедуре забора БАЛЖ достаточно 2–4 промывок легких, чтобы получить адекватный образец без разведения содержимого. В промывках отдельных сегментов легкого возврат первоначального объема жидкости обычно невелик, и может потребоваться 5 или 6 промывок. Многократное промывание легких необходимо в случаях, когда целью исследования является получение как можно большего количества макрофагов альвеол для функциональных анализов. Также для получения большего количества активных клеток можно применить массаж легких в перерывах между промывками [5].

При первой промывке легкого возврат БАЛЖ составляет 75% изначального объема, начиная со второй промывки, возвратный объем увеличивается до 100%. При промывке отдельного сегмента легкого обычно возвращается 40% изначального объема и 100% при последующих промываниях. Одним из маркеров активного воспалительного процесса легких (отек) является увеличение возвратного объема БАЛЖ после промывки в связи с выделением большого количества слизи в легких животного [5].

Компоненты бронхоальвеолярного лаважа

Непосредственно после отбора БАЛЖ образцы помещают на лед и хранятся в холодном состоянии. Последующие манипуляции (центрифугирование, отбор супернатанта и замораживание, если необходимо, ресуспендирование осадка) с образцом БАЛЖ необходимо начать по возможности быстро [5]. Для подсчета общего количества клеток образец БАЛЖ центрифугируют и ресуспендируют клеточный осадок [5, 7, 8, 12, 14–20, 22, 29–31]. Для получения чистого супернатанта необходимо удалить промытые клетки из образца БАЛЖ как можно быстрее, чтобы избежать утечки ферментов и биологически активных веществ в супернатант [5].

Основным компонентом БАЛЖ здоровых животных является легочный макрофаг (90% от общего количества клеток). Содержание нейтрофилов очень мало, и приток этих клеток является чувствительным индикатором воспалительного ответа. Лимфоциты в БАЛЖ обычно отсутствуют у крыс, мышей и хомяков, но они могут составлять до 10% клеток БАЛЖ у более крупных животных, таких как овцы, лошади и обезьяны. Эозинофилы встречаются в образцах БАЛЖ морских свинок. Индикатором воспалительной реакции на основе иммунного ответа является увеличение количества лимфоцитов или эозинофилов в образце БАЛЖ [5, 24].

При анализе биохимических показателей БАЛЖ можно изучить концентрацию белка [9, 11, 17, 18, 25, 29, 31] для мониторинга повышенной проницаемости альвеолярного/капиллярного барьера, которая возникает при воспалительной реакции [5, 9, 11].

При повреждении клеток легких высвобождается лактатдегидрогеназа (ЛДГ) в слизистую оболочку легких, поэтому увеличение активности ЛДГ в образцах БАЛЖ является биомаркером при острых и модельных респираторных заболеваниях [5, 24, 25].

β-Глюкоронидаза, являющаяся лизосомальным ферментом, при воспалительных процессах продуцируется нейтрофилами, которые собираются в месте повреждения клеток легких. Повышенная активность β-глюкоронидазы во внеклеточной жидкости является хорошим биомаркером активности макрофагов, нарушения проницаемости альвеолярных эпителиальных клеток [5, 34].

Увеличение активности щелочной фосфатазы является индикатором разрушения эпителия дыхательных путей [25]. Увеличение продуктов перекисного окисления липидов наблюдается при повреждении различных клеток легких и дыхательных путей, при остром повреждении легких грызунов, например при ингаляционном поступлении фосгена [11], также подобное наблюдали при трансфузионном остром повреждении легких собак [33]. При разрушении эпителия и поверхностно-активного слоя легких и дыхательных путей в образцах БАЛЖ крыс наблюдают увеличение глутатионов [11].

Ранними биохимическими маркерами воспаления легких являются фактор некроза опухоли-α и интерлейкин-1 (IL-1), цитокины, высвобождаемые из резидентных макрофагов, которые способствуют прикреплению циркулирующих воспалительных клеток к эндотелию. Эти цитокины стимулируют высвобождение факторов хемоаттрактанта, таких как IL-8, MIP-2 (нейтрофильный хемоаттрактант у грызунов), IL-6 и макрофаги, хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1), которые привлекают воспалительные клетки в альвеолы [6, 8, 10, 13, 15–17, 19, 21, 24, 28, 30].

Заключение

Методология забора БАЛЖ является достаточно простой для воспроизведения и получения данных о протекании респираторных воспалительных процессов. В целом, процедура забора БАЛЖ лучше всего подходит для выявления ранних признаков повреждения легких до того, как легкое стало настолько сильно затронуто, что вызывает проблемы с извлечением лаважа. Однако стоит принять во внимание следующие особенности: при заборе лаважа необходимо избегать любых повреждений легких и дыхательных путей; необходимо проводить манипуляции с образцами БАЛЖ по возможности сразу и в охлажденном состоянии. Получение БАЛЖ может быть полезным при исследовании заболеваний дыхательного тракта в экспериментах на животных.

В целом при планировании в эксперименте забора БАЛЖ необходимо заранее выбрать:

• метод забора (открытый, закрытый) в зависимости от дизайна исследования;
• вид животного – определяет объем БАЛЖ;
• состав БАЛЖ, который должен осуществляться с учетом возможных помех для определения целевых компонентов биологически активных веществ;
• количество БАЛЖ, что обеспечивает сохранность тканей легких и дыхательных путей.

В зависимости от дизайна исследования можно исследовать клеточный состав БАЛЖ, активность ферментов, содержание различных биологически активных веществ, как в составе БАЛЖ, так и в составе его клеточных компонентов.