Диет-индуцированные модели метаболических нарушений. Сообщение 6: экспериментальная анемия

Введение

Распространенность анемии среди населения нашей планеты, по данным ВОЗ, составляет около 2 млрд человек, причем даже в развитых странах ею страдают 18–20% населения. Наиболее часто анемия развивается у беременных и детей. Анемия как нередкое осложнение онкологических заболеваний, болезней почек, желудочно-кишечного тракта и др. вызывает гипоксию органов и тканей, усугубляет не только течение основной патологии, и сопутствующих заболеваний. Установлено, что анемия утяжеляет и обостряет течение ишемической болезни сердца, существенно увеличивая риск развития инфаркта миокарда [1].

Следует отметить, что среди всех типов анемий железодефицитная анемия составляет 80–95%, встречаясь почти у каждого 3-го человека. При этом по мнению А.Л. Верткина, пациентов (с анемией. – Прим. авт.) много, а лекарств мало [1]. Отсутствие средств, способных быстро и эффективно вылечить анемию, определяет необходимость поиска препаратов профилактики и лечения этой патологии, что невозможно без адекватных экспериментальных моделей.

Характеристика и типы анемии

Анемия – состояние, характеризующееся уменьшением содержания гемоглобина в крови. Согласно определению ВОЗ, на анемию указывает концентрация гемоглобина < 130 г/л у мужчин и 120 г/л у небеременных женщин, у пожилых людей – менее 120 г/л независимо от пола [1, 2].

Существует множество различных классификаций анемии в зависимости от взятых за основу показателей крови. Так, если за основу берется цветовой показатель, то различают гипо-, нормо- и гиперхромную анемию. Причем гипохромная анемия превалирует среди всех случаев заболевания. Однако в настоящее время в клинико-лабораторной практике принята классификация анемий, основанная на показателе среднего объема эритроцитов (MCV): микроцитарные (MCV < 80 фл – фемтолитр: 1 фемтолитр = 10–15 л), нормоцитарные (MCV — 80–100 фл) и макроцитарные анемии (MCV>100 фл) [1, 2]. Важную роль для проведения лечебно-профилактических мероприятий играет деление анемий по этиологическому признаку: железодефицитная (ЖДА), В₁₂-дефицитная, фолиево-дефицитная, геморрагическая, анемия хронических заболеваний и др. [1, 2].

ЖДА, обусловленные истощением запасов железа в организме, составляют 80–95% всех анемий (в среднем ЖДА отмечается у 30% населения земного шара) [3, 4]. Причины ЖДА разнообразны: острые или хронические кровопотери (травма, носовые, желудочно-кишечные, маточные и другие кровотечения), неполноценное по усвояемому железу питание, нарушение непосредственно усвоения железа при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и т.д. В клинике ЖДА у человека выделяют анемический и сидеропенический синдромы, отдельные признаки которых могут выявляться у лабораторных животных.

Анемический синдром, характерный для любого вида анемии, проявляется у человека головокружением, головными болями, шумом в ушах, мельканием мушек перед глазами, слабостью, утомляемостью, снижением работоспособности, хронической усталостью, бледностью кожи и слизистых, сердцебиением, одышкой при физической нагрузке. Сидеропенический синдром, связанный непосредственно с дефицитом железа в организме, характеризуется сухостью кожи, ломкостью и слоистостью ногтей, появлением койлонихий, извращением вкуса и обоняния, глосситом, дисфагией, ангулярным стоматитом, тахикардией и диастолической дисфункцией миокарда.

ЖДА у лабораторных животных (микроцитарная, гипохромная) проявляется задержкой роста, снижением массы тела, толерантности к физической нагрузке и познавательной активности, спленомегалией и кардиомегалией, ослаблением иммунитета (нарушение фагоцитоза и активности естественных киллеров, снижение выработки антител) [5, 6]. При этом наряду со снижением уровня гемоглобина в крови отмечается уменьшение размера эритроцитов и концентрации гемоглобина в них.

Рационы питания и виды животных, используемые для индукции анемии

Потребность в железе составляет (1 мг на 1 кг рациона): у крыс, мышей и песчанок – 35, морских свинок – 50, хомяков – 140, кроликов – 22,4, свиней 40–100, в том числе карликовых свиней – 80 [6, 7].

В экспериментальных исследованиях на грызунах, в частности на крысах, обычно используют полусинтетические рационы питания типа рациона AIN-93G (American Institute of Nutrition 93 Growth Purified Diet) или рациона TD.80396 (на основе AIN-76A) Харланской лаборатории США с низким содержанием железа (5,2–7,8–8 мг/кг рациона), обусловленным его наличием в составных компонентах корма (казеине, крахмале, растительных маслах, клетчатке и др.) [8–11] (табл. 1). Со стандартным рационом (35 мг/кг рациона) крысы получают обычно около 2 мг железа на 1 кг массы тела [4]. В свою очередь стандартный рацион морских свинок содержит железа около 100 мг/кг рациона, а железодефицитный рацион – 6,15 мг/кг [12].

Таблица 1

Состав рационов питания AIN-93G и TD.80396 (на основе AIN-76A) Харланской лаборатории США, используемых для индукции анемии у крыс и мышей

Примечание. * – безжелезистая минеральная смесь рациона AIN-93G содержит следующие компоненты (г/кг смеси): карбонат кальция (357); калий фосфорнокислый однозамещенный (157); трицитрат калия моногидрат (102); NaCl (74), K2SO4 (46), MgO (24); карбонат цинка (1.65); марганца карбонат (0,63); карбонат меди (0.3); раствора KIO3 (0,01); натрия селенит (0.01025); хромосульфат калия 12 гидрат (0,275); парамолибдата аммония гидрат 4 (0,00795); мета-силикат натрия 9 гидрат (1.45); хлорид лития (0,0174); борную кислоту (0,0815); фторид натрия (0,0635); карбонат никеля (0,0318); аммония ванадат (0,0066) и мелко измельченную сахарозу (235); ** – витаминная смесь рациона AIN-93G содержит следующие компоненты (г/кг корма): тиамина гидрохлорид (0,6); рибофлавин (0,6); пиридоксин HCl (0,7); никотиновую кислоту (3,0); D-кальция пантотенат (1,6); фолиевую кислоту (0,2); D-биотин (0,02); цианокобаламин (0,0025); ретинила пальмитат (400,000 МЕ); DL-α-токоферола ацетат (7,500 МЕ); холекальциферол (100000 МЕ); к-1 (0,075), мелкоизмельченную сахарозу (974,655).

Исследования обычно проводятся в 2 этапа. На 1-м этапе животных разделяют на 2 группы: 1-я группа (контроль анемии) – 6–10 животных на стандартном рационе питания; во 2-й группе животные находятся на рационе с низким содержанием железа, их число зависит от числа запланированных к исследованию лечебных средств или их концентраций. Обычно для развития анемии достаточно 3–4 нед: о наличии анемии судят, сравнивая показатели крови подопытных животных с контрольными. Затем животных с анемией разделяют на несколько групп по 6–10 животных в каждой, они продолжают получать рацион с низким содержанием железа. При этом одна из этих групп служит контрольной для оценки эффективности исследуемых средств, а животные других групп получают на фоне диетиндуцированной анемии исследуемые лечебно-профилактические средства еще 3–6 нед [4, 13].

Для моделирования анемии используются в основном крысы линий Wistar и Sprague-Dawley [8, 11], реже – мыши линии C57BL/6 и некоторых других [14, 15], преимущественно – самки и детеныши. Еще реже используются морские свинки, свиньи и мини-свиньи [12, 16]. Исследования обычно начинают с животных молодого возраста, так они более чувствительны к дефициту железа, например с крыс с 4–5-недельного возраста массой тела 65–70 г [8].

Показатели, используемые для оценки анемии у животных

Для диагностики анемии рекомендуется проведение развернутого анализа крови: концентрация гемоглобина, количество эритроцитов, гематокрит (доля эритроцитов в цельной крови) и эритроцитарные индексы, количество ретикулоцитов, тромбоцитов и их индексы [17]. При этом основной лабораторный показатель для оценки анемии – концентрация гемоглобина крови и эритроцитов [17].

Снижение уровня гемоглобина крови, свидетельствуя о развитии анемии, позволяет оценить степень ее тяжести. Для более точной характеристики анемии проводят анализы, характеризующие степень насыщения эритроцитов гемоглобином: упрощенно с помощью цветового показателя (ЦП) или углубленно – с помощью эритроцитарных индексов, таких как MCH (среднее содержание гемоглобина в эритроците) и МСНС (среднее содержание гемоглобина во всех эритроцитах, т.е. всей крови). ЦП – среднее содержание гемоглобина в одном эритроците (при ЖДА снижается). В зависимости от степени насыщения эритроцитов гемоглобином выделяют нормохромию (адекватное насыщение), гипохромию (недостаточное насыщение) и гиперхромию (избыточное насыщение). Соответственно различают нормохромные, гипохромные и гиперхромные анемии. Для более точной диагностики анемии необходимо определение показателя среднего объема эритроцитов (MCV – Mean Corpuscular Volume): микроцитоз (MCV<80 фл), нормоцитоз (MCV — 80–100 фл) и макроцитоз (MCV>100 фл) [1, 2, 17]. 

Для диагностики ЖДА исследуют также показатели обмена железа: сывороточное железо, ферритин, трансферрин. Следует отметить, что определение только сывороточного железа недостаточно, так как оно составляет < 1% всего железа в организме и его уровень снижается только при выраженном дефиците железа. В свою очередь, ферритин – основная форма депонированного железа, самый информативный индикатор его запасов в организме 18, 19]. Трансферрин характеризует железосвязывающую способность сыворотки крови, увеличивающуюся при ЖДА.

В ряде исследований оценивают активность окислительно-восстановительных ферментов, сдержащих железо (супероксиддисмутаза – СОД, глутатионпероксидаза – ГП) [4]. При развитии ЖДА активность этих ферментов падает.

Таблица 2

Некоторые показатели, используемые для оценки ЖДА у разных животных на различных рационах

Примечание: СР – стандартный рацион; ЖДР – железодефицитный рацион; Hb – гемоглобин крови; MCH – среднее содержание гемоглобина в эритроците; МСНС (среднее содержание гемоглобина во всех эритроцитах); ЖП – железо печени; ЖС – железо сыворотки; СОД – супероксиддисмутаза; ГП – глутатионпероксидаза; АЕ – активные единицы; ОЖСС – общая железосвязывающая способность сыворотки крови (трансферрин); ФС – ферритин сыворотки крови; * – p<0,05.

Как видно из табл. 2, у крыс, у мышей, получающих железодефицитный рацион, отмечается снижение уровня гемоглобина, более выраженное у крыс и мышей линии Kunming по сравнению с мышами линии C57BL/6. Причем у крыс выявлена четкая тенденция к уменьшению среднего содержания гемоглобина в отдельно взятом эритроците, так во всех эритроцитах. Кроме того, у животных, наряду с уменьшением количества эритроцитов, уменьшается и их средний объем, снижается содержание железа в сыворотке крови в печени, концентрация ферритина сыворотки, на фоне резкого повышения общей железосвязывающей способности сыворотки крови. Одновременно существенно снижается активность СОД и ГП. На серьезные нарушения в организме подопытных животных указывает также выраженное снижение массы тела. Вышеперечисленные изменения свидетельствуют о развитии у животных микроцитарной, гипохромной ЖДА с явлениями нарушения окислительно-восстановительных процессов, связанными с дефицитом железа, необходимого для обеспечения активности соответствующих ферментов.

Особо выраженные изменения при ЖДА отмечаются у новорожденных поросят, находившихся с 3-го по 28-й день после рождения на ограниченном по железу питании в сравнении с животными на стандартном рационе питания: гемоглобин (57,3±7,7 в сравнении с 123,7±6,1 г/л), железо сыворотки крови (8,85±2,49 в сравнении с 151,63±27,85 мкмоль/л), насыщение трансферрина железом (1,22±0,43 в сравнении с 52,18±10,41%) и негемовое железо печени (0,24±0,07 в сравнении с 10,30±0,37 ммоль/мг) [16].

Как показывают многочисленные исследования [4, 8, 9, 20, 21], использование диет-индуцированной анемии позволяет в доклинических экспериментах оценить эффективность изучаемых лекарственных средств и их дозировок для последующей апробации в клинических наблюдениях.

Заключение

Таким образом, широкое распространение анемии, преимущественно железодефицитной, среди населения земного шара определяет необходимость постоянного поиска средств профилактики и лечения этой патологии, что невозможно без адекватных экспериментальных моделей. Для моделирования анемии используются в основном крысы и мыши диких пород (Wistar, Sprague-Dawley, C57BL/6 и др.), преимущественно – самки и детеныши. При этом для точного дозирования основных макро- и микроэлементов питание животных осуществляют за счет полусинтетических рационов питания со сниженным содержанием железа (5,2–7,8–8 мг/кг рациона при норме 35–50 мг/кг), типа рационов AIN-93G и D.80396.

Для оценки развития анемии и лечебного действия исследуемых средств у экспериментальных животных рекомендуется исследовать как морфологические (количество эритроцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов и их индексы), так и биохимические показатели (концентрация гемоглобина крови и эритроцитов, сывороточное железо, ферритин, трансферрин, активность окислительно-восстановительных железосодержащих ферментов). Полученные в эксперименте данные о изменении состояния крови и обмена веществ дают представление о направленности этих изменений при развитии экспериментальной анемии. Так, происходит снижение массы тела, содержания гемоглобина в крови в отдельных эритроцитах, железа в сыворотке крови в печени, а также ферритина и активности ряда окислительно-восстановительных ферментов. Одновременно повышается общая железосвязывающей способность сыворотки крови.