Белозерцева И.В., Меркулов Д.Д., Вилитис О.Е., Скрябин Б.В. Аппаратный способ определения стадий эстрального цикла у мелких лабораторных грызунов. Лабораторные животные для научных исследований. 2018; 4. https://doi.org/10.29296/2618723X-2018-04-10
Резюме. На самках мышей и крыс выполнена апробация нового инструментального метода/устройства для определения стадий эстрального цикла у мелких грызунов. Циклические изменения активного сопротивления (RS) слоя эпителиальных клеток слизистой оболочки влагалища измеряли с помощью нового детектора MED-PRO 100 (Elmi Ltd., Latvia). Активное сопротивление измеряли на частоте 1 кГц, вставляя зонд детектора (l = 14 мм, d = 1,82 мм; диапазон измерения – 0–50 кОм) во влагалище животного на 1–2 с. Результаты измерений соотносили с цитологической картиной влагалищных мазков, классического способа определения стадий эстрального цикла. Было установлено, что новый метод дает точное определение стадии в «пиковых» значениях и его целесообразно использовать, поскольку он нетравматичен для животного и не так трудоемок, как классический цитологический метод. Построенные кривые активного сопротивления для нескольких эстральных циклов были схожи (особенно у крыс), а изменения активного сопротивления соответствовали стадиям, определяемым по цитологической картине мазков. Однако максимальные значения активного сопротивления соответствовали разным стадиям цикла у мышей и крыс. У крыс активное сопротивление было значимо больше в проэструсе (>5 кОм) по сравнению с другими стадиями цикла и в метэструсе по сравнению с эструсом и диэструсом. У мышей максимальному значению активного сопротивления соответствовала стадия эструса. Мы пришли к выводу, что использование устройства MED-PRO 100 обеспечивает точный подход к оценке эстрального цикла у крыс и мышей. Это может быть использовано для определения оптимального времени скрещивания животных; гормональной суперовуляции или технологий искусственного оплодотворения, а также для оптимизации поведенческих, фармакологических и токсикологических исследований, выполняемых на самках лабораторных грызунов.
Проведение фармакологических [1, 2] и токсикологических [3] исследований на самках лабораторных грызунов; выбор оптимального времени скрещивания для получения беременных (или псевдобеременных) самок при создании трансгенных животных или искусственном оплодотворении [3, 5, 6, 7], поддержания колоний лабораторных животных, особенно линий с низкой фертильностью [8], а также вскрытие для морфологических исследований [3], требуют определения стадии эстрального цикла. Учет данного фактора может оптимизировать выполнение «профильных» экспериментов и повысить результативность воспроизводства лабораторных животных. Начиная с 20-х годов ХХ века [9, 10] используется метод оценки цитологической картины смыва или мазка из влагалища самки («золотой стандарт») для определения стадии эстрального цикла, в котором она находится. Данная процедура выполняется в несколько этапов, требующих определенных временных затрат, а также наличие микроскопа и ряда расходных материалов – пипеток, предметных стекол, красителей и пр. При этом способы окрашивания мазков и субъективность анализа готовых препаратов предварительно обученным персоналом также могут влиять на конечные результаты. Кроме прочего было показано, что многократные ежедневные смывы и взятие мазков с помощью тампонов могут нарушать протекание циклов [11] и даже вызывать ороговение клеток эпителия влагалища у овариэктомированных самок крыс [12]. В связи с этим, поиск быстрого и надежного аппаратного способа определения стадий полового цикла у самок лабораторных животных представляется весьма актуальной задачей.
Разработки детекторов для определения времени овуляции по электрическому сопротивлению стенок влагалища у сельскохозяйственных видов животных начались довольно давно. Еще в 1961 г. в СССР было оформлено авторское свидетельство «Способ определения оптимального времени осеменения коров» [13], а чуть позже был получен патент №178602 на прибор для измерения электрического сопротивления стенок влагалища у коров [14]. Упоминание о детекторах стадий полового цикла у лабораторных грызунов – крыс [15, 16, 17] и морских свинок [18] начали появляться с конца 1970-х гг. Однако до настоящего времени среди доступных коммерческих детекторов не существует надежного аппарата для мышей, о чем некоторые производители данного оборудования открыто предупреждают на своем сайте (например, для Model МК-12 (Muromachi Kikai Co., Ltd., Япония) – https://muromachi.com/en/archives/english/2108/).
В 2015 г. в компании Elmi (Латвия) была начата разработка детектора MED-PRO (рис. 1), ориентированного в первую очередь на определение стадий эстраль-ного цикла у мышей. В настоящее время эта разработка защищена патентом LV15278 [19].
В существующих детекторах эстрального цикла грызунов электрическое сопротивление слизистой влагалища определяется измерением электрического импеданса (Z), который представляет собой геометрическую сумму активного сопротивления (АС) электрической цепи RS и реактивного сопротивления XС :
Z2 = RS2 + XС2.
RS является величиной, обратной величине электропроводности ткани, которая мало зависит от частоты переменного тока, в то время как реактивная составляющая XС импеданса зависит от частоты электрического тока.
При измерениях на переменном токе Z зависит от наличия границ раздела в системе, на которых может происходить накопление зарядов – поляризация. Свойства границ раздела (в биологическом объекте это главным образом различные мембраны клеток) могут быть описаны, если учесть емкость С, сопротивление которой XС зависит от частоты, на которой производится измерение:
XС = -1/(ωC),
где ω = 2π f – круговая частота, f – частота в Гц.
Измерение электропроводимости биологических систем на постоянном токе крайне затруднено из-за высокой степени поляризации на поверхностях мембран клеток и электродов зонда, поэтому для измерений применяют переменный ток.
Для существенного повышения точности измерений в новом детекторе эстрального цикла MED-PRO 100 применен метод синхронного детектирования [19], который обеспечивает селективное измерение только компоненты активной части сопротивления RS, устраняя, таким образом, влияние C на результат измерения.
В отличие от массивных зондов у ныне существующих детекторов эстрального цикла, требующих времени на температурную
стабилизацию показателя, созданный в Elmi детектор MED-PRO 100 имеет зонд миниатюрных размеров (рис. 1, справа). Он
имеет два электрода (∅ = 1,82 мм, шириной по 1,2 мм,
материал – AISI316, зазор между
электродами – 1,2 мм) с малой теплоемкостью способствует быстрому (<1 с) выравниванию температуры между
датчиком и тканями. Кроме этого, введение во влагалище зонда минимального размера оказывает менее стрессовое и
травмирующее воздействие на самок мышей, способствуя тем самым точности выполняемого измерения. Основные технические
характеристики детектора MED-PRO 100 приведены в табл. 1.
В 2016 году опытные образцы MED-PRO 100 были переданы в исследовательские лаборатории для апробации у животных.
Замеры активного сопротивления (АС) стенок влагалища выполняли у мышей и крыс, предварительно прирученных к рукам
экспериментатора. Зонд вводили во влагалище на полную длину (рис. 2), при этом у крыс его смещали в одну из сторон,
прижимая
к стенке влагалища на 1–2 с. После каждого измерения зонд обтирали спиртосодержащей
салфеткой.
При правильной фиксации самок мышей стабилизация показателя АС происходила в течение первой секунды. Из-за миниатюрности зонда при выполнении измерений у крыс было cложно обеспечить постоянную площадь соприкосновения датчика со стенкой влагалища, в связи с чем при пиковых значениях показателя, колебания могли достигать ±1 кОм (до 10%). В этом случае регистрировали расчетную величину – среднее арифметическое.
Для верификации инструментального метода определения стадии эстрального цикла использовали традиционный метод влагалищных мазков, оценивая соотношение эпителиальных клеток с ядрами, лейкоцитов и ороговевших клеток эпителия («чешуек»). Смывы влагалища делали сразу после измерения АС. Использовали стерильный 0,9% изотонический раствор (автоматические пипетки со сменными наконечниками, 25 мкл) для мышей и дистиллированную воду (глазные пипетки, около 70 мкл) для крыс.
У мышей наблюдали высокую индивидуальную вариабельность показателей АС, при этом пиковые значения соответствовали стадии эструса (рис. 3). Это согласуется с недавно опубликованными данными [19], полученными с использованием разработанного для крыс детектора Model MK-11 (Muromachi Kikai Co., Токио, Япония) и сенсора для мышей MP-35 (∅ = 3,5 мм, покрытые золотом электроды шириной 3 и 1 мм размещены с зазором 3 мм). В данном исследовании измерения импеданса выполняли у мышей, находящихся под анестезией, что обеспечивало стабильную локализацию закрепленного в стереотаксической установке зонда и сопоставимость оказываемого им давления на стенки влагалища, поскольку ранее авторами было выявлена высокая вариабельность биоэлектрического импеданса влагалища при выполнении измерений далее 7 мм от устья матки [19]. Приводимые в работе показатели также свидетельствуют о высокой индивидуальной вариабельности измеряемого показателя: в проэструсе – 1,69±1,63 кОм (n=18); в эструсе – 3,78±2,24 кОм (n=20); в метэструсе – 1,11±0,68 кОм (n=12); в диэструсе – 0,97±0,32 кОм (n=13). В более ранней работе [21], где использовался тот же детектор, было показано, что у самок мышей CD-1 уровень импеданса всегда выше в переходный период от проэструса к эструсу и в эструсе, при этом колебания импеданса более выражены у молодых самок (3 мес > 15 мес) и полностью сглаживаются к 20 месячному возрасту.
В отличие от самок мышей, у крыс стока Wistar в возрасте 3 мес, содержащихся в группах однопометников, наблюдали
регулярные циклы колебания АС стенок влагалища. Замеры производили ежедневно за 1-2 часа до наступления темной фазы
суточного цикла (12 ч свет /12 ч темнота). У 72% самок (n=61) длительность цикла составляла 4 дня (рис. 4).
Усредненные по 5 циклам показатели АС стенки влагалища (n=44) представлены на рис. 5. Однофакторный дисперсионный
анализ (на рангах) с повторными измерениями показал значимые различия АС стенки влагалища у крыс, находящихся в
разных фазах эстрального цикла (Fr=476,7, df=3, p<0,001). Максимальное значение АС наблюдали в
фазу проэструса (рис. 3 и 5). Кроме «основного пика» АС в стадии проэструса наблюдали значимое
увеличение данного показателя на третий день эстрального цикла (стадия метэструса) по сравнению как с предшествующим
(эструс), так и с последующим (диэструс) днями (рис. 4 и 5). Сходный диапазон изменения АС стенки влагалища
(0,9–17 кОм, данные не представлены) регистрировали у самок НП (линия с низким порогом возбудимости –
высоковозбудимая) и ВП (линия с высоким порогом возбудимос-
ти – низковозбудимая) крыс [22]. Полученные
результаты о пиковых значениях АС стенок влагалища самок крыс в стадии проэструса согласуются с результатами более
ранних работ, в которых оценивали импеданс [18, 23].
В целом из-за индивидуальной вариабельности показателей точное определение стадий эстрального цикла (кроме проэструса у крыс и эструса – у мышей) по данным измерения АС стенки влагалища возможно только при выполнении ежедневной оценки в течение нескольких половых циклов. Такая ситуация соотносится с результатами классического способа определения стадии эстрального цикла по цитологической картине влагалищного мазка, когда знание клеточного состава предшествующих мазков существенно увеличивает точность определения текущей стадии [3].
На основании полученных результатов можно заключить, что детектор MED-PRO 100 является перспективным средством для
определения стадий эстрального цикла и у крыс, и у мышей и может быть использован не только для целей
воспроизводства лабораторных грызунов и/или получения их «датированной беременности», но и в длительных
поведенческих, фармакологических и токсикологических исследованиях. Для валидации данного устройства требуются
дальнейшие исследования на различных линиях/стоках лабораторных мышей и крыс, а также других видах мелких
лабораторных грызунов. При проведении исследований, однако, следует определять наличие влагалищных инфекций и
воспаления, поскольку детектор может давать ложнонегативные результаты, не выявляя пики активного сопротивления у
циклирующих са-
мок [24].
Авторы выражают признательность М.Г. Семиной за оказанную техническую помощь при проведении данного исследования.