Диет-индуцированные модели метаболических нарушений. Сообщение 3: экспериментальный сахарный диабет

Введение

Несмотря на значительный прогресс в лечении сахарного диабета (СД), в последние 2 десятилетия отмечается непрекращающийся рост заболеваемости СД как во всем мире, так и в Российской Федерации, причем рост происходит в основном за счет больных, страдающих СД  типа 2 (СД2). Так, например, если общее число больных СД в РФ на конец 2016 г. составляло 4,348 млн человек (2,97% населения РФ), то больных СД2 среди них было чуть больше 4 млн (92%), СД типа 1 (СД1) – 255 тыс. (6%), и на другие типы СД приходилось всего 75 тыс. (около 2%) [1]. Основные причины ухудшения качества жизни, инвалидизации и смертности больных СД: хронические осложнения, обусловленные гипергликемией (диабетическая нефропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая стопа, диабетическая нейропатия, атеросклероз и др.) [2].

В целях совершенствования профилактики и лечения осложнений СД постоянно изучаются различные аспекты патофизиологии СД, механизмы антидиабетического действия новых лекарственных средств. Для этого необходимы широкие доклинические исследования с использованием экспериментальных моделей на животных: подбор наиболее чувствительных к развитию СД видов животных, эффективных методов индуцирования СД, адекватных показателей характеристики СД. В настоящее время создано много моделей экспериментального СД, однако для моделирования СД2 подходят далеко не все из них.

Характеристика сахарного диабета

СД – хроническое неинфекционное заболевание, темпы распространения которого за последние 2 десятилетия приобрели масштаб эпидемии [1]. СД характеризуется абсолютным или относительным дефицитом гормона инсулина и последующим нарушением обмена веществ, прежде всего – углеводного. Под абсолютным дефицитом инсулина понимают недостаточное образование этого гормона в поджелудочной железе (преимущественно СД1), под относительным дефицитом – нарушение действия инсулина на клетки организма при количественно достаточном его образовании в поджелудочной железе (инсулинорезистентность, характерная для СД2) [2]. В патогенезе инсулинорезистентности важное значение придается ожирению, которым страдают большинство больных СД2.

Для СД характерны острые и хронические осложнения. Острые осложнения – гипогликемические и гипергликемические состояния (кетоацидоз) – хорошо поддаются коррекции современными противодиабетическими средствами, хотя при этом необходим постоянный контроль за содержанием глюкозы крови. В настоящее время наиболее серьезной проблемой являются хронические (поздние) осложнения СД, которые служат основными причинами ухудшения качества жизни, инвалидизации и смертности больных. В основе поздних осложнений лежит хроническая гипергликемия, сопровождающаяся поражением мелких кровеносных сосудов – микроангиопатии (нефропатия, ретинопатия, диабетическая стопа и др.) и крупных кровеносных сосудов – макроангиопатии, а также поражением периферической нервной системы – нейропатии. 

В основе диабетических поражений крупных сосудов (макроангиопатий) лежит атеросклероз, риск развития которого при СД2 возрастает в несколько раз. В свою очередь, диабетические поражения мелких сосудов, а также характерные для СД2нарушения липидного обмена, тоже играют важную роль в механизмах развития макроангиопатий. У больных СД значительно чаще и тяжелее протекает артериальная гипертензия, в том числе вторичная артериальная гипертензия, обусловленная поражением почек (диабетической нефропатией).

Рационы питания, используемые для индукции СД

Большинство существующих в настоящее время экспериментальных моделей СД (хирургическая, химическая, эндокринная, иммунная, генетическая) не подходят для изучения СД2. Так как в этиологии СД2 (так же, как и ожирения) у человека основное значение имеет избыточное по калорийности питание, наиболее адекватными представляются диет-индуцированные модели на различных видах животных. Рацион питания оказывает существенное влияние на развитие СД2. Так, например, у мышей C57BL/6 для развития ожирения и СД2 требуется высокожировой рацион (ВЖР) (60% жира) питания
(табл. 1), причем более быстрый и выраженный эффект достигается при добавлении в него большого количества сахарозы или фруктозы [3]. У крыс линии Wistar для индукции инсулинорезистентности использовали высокофруктозный рацион (35–60% ккал за счет фруктозы) [4, 5]. Для индукции СД2 у мини-свиней также рекомендуется ВЖР с добавлением большего количества сахарозы (см. табл. 1) [6]. В свою очередь, у предрасположенных к ожирению мышей ли-
нии NZO ожирение и СД развиваются как при 40%, так и при 15% жира в рационе питания, в то время как рацион с высоким содержанием клетчатки значительно тормозит у них развитие ожирения и СД [7]. Однако у таких генетически модифицированных линий мышей, как ApoE-/-, LDLr-/-, LDLr-/-ApoB100/100, СД вообще не развивается даже на высококалорийных рационах [3].

Виды животных, используемые для индукции сахарного диабета

Для моделирования СД2 в основном применяются грызуны (мыши и крысы, реже – морские свинки, песчанки и дегу) и нечеловекообразные обезьяны [11, 12]. В настоящее время все шире начинают использоваться мини-свиньи [13].

Модели сахарного диабета на грызунах

В экспериментальных моделях СД2 используются как генетически модифицированные (инбредные) животные [(мыши db/db, мыши NZO (New Zealand Obese), мыши TH (TALLYHO/Jng), крысы Zucker Diabetic Fatty (ZDF) и др.)], так и аутбредные (мыши линий C57BL/6 и BALB/c, крысы линии Wistar и др.) [4, 11, 14–16].

По мнению R. Kluge et al. [7], инбредные мыши имеют сходный с человеком патогенез развития, связанный с ожирением. Поэтому они идеально подходят для исследования проявлений СД2 у человека. Однако генетическая однородность инбредных линий является не только преимуществом, но и ограничивает потенциал их применения. Так как особи конкретной инбредной линии мышей генетически идентичны, то маловероятно, что у одной линии представлены все патогенетические механизмы такого комплексного заболевания, как СД2. Поэтому для всесторонней оценки механизмов как самого СД2, так и изучаемых препаратов, требуются исследования на нескольких линиях инбредных мышей для получения полной картины [7].

Разные линии инбредных мышей, используемых для моделирования СД2, существенно различаются между собой. Так, если самой яркой характеристикой мышей NZO является выраженное ожирение (масса тела у них к 3 мес достигает 45 г, а в дальнейшем может достигать 100 г и более), то мыши линии TH к 3 мес весят 35 г, в то время как контрольные линии диких мышей C57BL/6 – 27 г [7, 16]. Практически все исследователи отмечают, что молодые мыши возрастом до 4 нед, независимо от пола, толерантны к введению глюкозы, однако после полового созревания (раньше – у самцов и чуть позже – у самок) у них развивается нарушение толерантности к нагрузке глюкозой [16]. Нарушение толерантности к глюкозе у животных сопровождается гиперсекрецией инсулина (гиперинсулинемией) с последующим развитием инсулинорезистентности: средний уровень инсулина в плазме крови (не натощак) достигает 6±1 нг/мл – у самок и 8±1 нг/мл – у самцов мышей линии TH, в то время как у мышей линии C57BL/6 он составляет всего 0,4±0,1 нг/мл – у самок и 0,6±0,2 нг/мл – у 6-недельных самцов [16].

Модели сахарного диабета на кроликах

У кроликов сложно вызвать СД, так как в их рацион питания, наряду с высоким содержанием жира и сахарозы, должно входить довольно много клетчатки (см. табл. 1), которая предупреждает развитие инсулинорезистентности и гипергликемии. Это подтверждается многими исследователями, показавшими незначительные изменения содержания глюкозы и инсулина в сыворотке крови, даже при длительном применении (28 нед) рационов с высоким содержанием жира и углеводов (табл. 2) [9, 17]. Однако через 36 нед индекс инсулинорезистентности начинает существенно превышать таковой у контрольных животных (см. табл. 2) [9].

Модели сахарного диабета на крупных животных

В настоящее время, по мнению большинства ученых, наиболее подходящие модели для изучения СД2 – мини-свиньи, которые гораздо ближе к человеку, чем грызуны [13]. У мини-свиней с диет-индуцированным ожирением большинство симптомов, ассоциированных с метаболическим синдромом, в том числе и инсулинорезистентность и нарушение толерантности к глюкозе, развиваются в течение 5–6 мес после начала кормления рационом с высоким содержанием сахара и жира. Однако для развития явной гипергликемии, характерной для СД2, требуется несколько лет. Поэтому для ускорения индукции СД2, мини-свиньям с уже развившимся ожирением подбирают небольшие индивидуальные дозы стрептозотоцина, который выборочно повреждает часть инсулинсинтезирующих β-клеток поджелудочной железы, способствуя более раннему развитию гипергликемии. При этом доза стрептозотоцина должна быть такой, чтобы вырабатывалось достаточно инсулина для поддержания избыточной массы тела. При правильном подборе дозы стрептозотоцина секреция инсулина может быть ограничена на таком уровне, чтобы на фоне развития гипергликемии оставалось ингибирование липолиза без дополнительного введения инсулина [13].

Показатели для оценки развития сахарного диабета у разных видов животных

О развитии СД2 в условиях эксперимента судят в первую очередь по содержанию в плазме крови глюкозы натощак, инсулина и гликозилированного гемоглобина, по результатам теста на толерантность к глюкозе после ее введения через рот или внутриперитонеально, а также гистологии и гистохимии поджелудочной железы [6, 8, 10, 17, 18]. Кроме того, оценивают количество β-клеток в островках поджелудочной железы, определяют площадь распределения сахарной кривой и рассчитывают различные индексы (индекс инсулинорезистентности, индекс массы тела и др.). Косвенные показатели: масса тела и другие антропометрические данные, содержание триглицеридов, холестерина и его фракций, маркеры воспаления (интерлейкин-6, фактор некроза опухоли и т.п.) и др. [8, 10, 11, 17, 19]. Некоторые из указанных показателей, характерные для различных животных, используются в диет-индуцированных моделях СД2 (см. табл. 2).

Исходя из данных табл. 2, можно проследить быстрое развитие гипергликемии, инсулинорезистентности и рост гликозилированного гемоглобина у мышей на фоне только ВЖР. Однако у кроликов проявления СД2 выражены слабо и развиваются очень медленно (см. табл. 2). Вместе с тем у мини-свиней признаки возникновения СД2 развиваются гораздо лучше и быстрее, чем у кроликов: рост уровня глюкозы – до 10,27±2,25 ммоль/л в сравнении с 4,77±0,57 ммоль/л у контрольных животных, инсулина – 17,43±3,80 пмоль/л в сравнении с 7,65±1,33 пмоль/л, а инсулинорезистентность возрастает почти в 5 раз (см. табл. 2).

Заключение

Таким образом, для моделирования СД2 лучше всего подходят грызуны (преимущественно – мыши, в том числе и аутбредных линий), а также мини-свиньи, которых стали шире применять в последнее время. Как для моделей метаболического синдрома и ожирения, наиболее близкими по этиологии и механизмам развития к СД2 у человека также являются диет-индуцированные модели, среди которых наиболее эффективны высокожировые рационы, обогащенные сахарозой или фруктозой. Для моделирования СД следует использовать половозрелых животных, так как молодые животные, в частности мыши возрастом до 4 нед устойчивы к введению больших доз глюкозы и только после полового созревания у них развивается нарушение толерантности к нагрузке глюкозой. Для ускорения индукции СД2, в том числе у мини-свиней, рекомендуется использовать небольшие, подбираемые индивидуально, дозы стрептозотоцина, чтобы полностью не разрушать β-клетки поджелудочной железы аналогично ситуации при СД2.

Эффективность исследуемых лечебно-профилактических мероприятий у животных с СД2 оценивают на основании определения показателей глюкозы, инсулина и гликозилированного гемоглобина плазмы крови, гистологии и гистохимии поджелудочной железы и др. органов. Рассчитывают также количество β-клеток в островках поджелудочной железы, площадь распределения сахарной кривой, индекс инсулинорезистентности и др. Косвенно об эффективности исследуемых лечебно-профилактических мер судят на основании показателей липидного обмена (триглицеридов, холестерина и его фракций), маркеров воспаления (интерлейкин-6, фактор некроза опухоли и т.п.) и др.