Активация эндокринной системы семенников мышей линии C57BL/6J в ответ на сексуальный стимул

Введение

Успех проведения экспериментальной работы на млекопитающих во многом зависит от выбора экспериментальной модели и ее адекватности поставленным в исследовании задачам. Лабораторная мышь представляет собой признанную модель для проведения широкого круга экспериментальных исследований различной направленности, а работа на линейном материале является необходимым условием для получения достоверных и воспроизводимых результатов. Между тем большое количество линий мышей, прошедших к настоящему времени сотни поколений близкородственных скрещиваний в ходе отбора по тому или иному признаку, существенно затрудняют задачу исследователя по выбору адекватной для решения модели.

В настоящее время выделены 3 группы линий лабораторных мышей, существенно различающихся по происхождению и селекционным программам получения животных [10]. Первую обширную группу составляют высоко инбредные линии CBA, C3H, BALB/c, AKR, SWR, DBA/1 и DBA/2, вторую – линии семейства С57. Показано, что геном лабораторных мышей линий С57BL/6 и C57BL/10 соответствует геному домовой мыши Mus musculus domesticus [18]. На этом основании можно полагать, что предки лабораторных мышей первой группы представляют собой другой подвид рода Mus – Mus musculus musculus. Два этих подвида домовой мыши Mus musculus L. значительно различаются по популяционной биологии, структуре иерархических отношений и территориальному поведению самцов.

Ранее при изучении особенностей половой активации и механизмов нейроэндокринных сдвигов у самцов лабораторных мышей и крыс показано резкое повышение уровня тестостерона в плазме крови как при прямом сексуальном контакте, так и в условиях, исключающих непосредственное взаимодействие между партнерами [1, 5]. Основным индуктором такого повышения являются хемосигналы (смесь летучих и нелетучих соединений), выделяемые самкой [2, 12]. Данная активация гипоталамо-гипофизарно-семенникового комплекса (ГГСК) имеет важное физиологическое значение при копуляции [6, 8, 20]. Отмечается и способность тестостерона снижать болевую чувствительность и тревожность организма, что, в конечном итоге, оптимизирует половой процесс [17]. Данные эффекты тестостерона у самцов мышей могут быть связаны с его быстрой ароматизацией в эстрадиол, поскольку ароматазная активность в мозге меняется в течение нескольких минут, изменяя при этом уровень эстрадиола [12].

Между тем в ряде исследований при сексуальном предъявлении самцам самки активацию ГГСК комплекса обнаружить не удалось [1, 5, 17]. Показано, что даже у животных одного вида можно выделить генотипы с четким повышением тестостерона в крови после 30–40-минутного предъявления рецептивной самки и генотипы, у которых в тех же экспериментальных условиях не было изменений эндокринной функции семенников [1, 5]. В связи с этим возникает закономерный вопрос: является ли повышение тестостерона в крови самца при половом возбуждении универсальным или это особенность мышей определенного генотипа. Особое внимание привлекают самцы линии C57BL/6J,
для которых, с одной стороны, не было показано активации эндокринной функции семенников в условиях сексуального взаимодействия [1, 5, 17], с другой – экспериментально продемонстрирована специфическая аносмия к изовалериановой кислоте – важнейшего компонента вагинальных выделений [4, 13, 22].

Цель настоящего исследования – детальное изучение динамики уровня тестостерона в крови самцов линии C57BL/6J при предъявлении сексуального стимула и его сопоставление с изменяющимся при этом половым мотивационным поведением.

Материал и методы

Опыты проведены на половозрелых, сексуально неопытных самцах лабораторных мышей линии C57BL/6J, полученных в центре коллективного пользования «Генофонды лабораторных животных» Института цитологии и генетики СО РАН. Тестирование мышей проводили в зимний период в клетках (28×14×10 см), разделенных на 2 половины пластиковой перегородкой с небольшими отверстиями диаметром 7 мм. За 3 сут до опыта в 1 из отсеков помещали испытуемого самца для адаптации к новым условиям содержания и снятия социального эффекта группового содержания. В день эксперимента в пустой отсек клетки с самцом на 10-й, 20-й, 30-й, 40-й, 50-й или 60-й минутах помещали рецептивную самку линии BALB/c [6, 7]. Концентрацию тестостерона в плазме крови определяли иммуноферментным методом с использованием наборов «Стероид ИФА-тестостерон-01» отечественного производства фирмы «Алкор-Био» (Санкт-Петербург). Самки мышей линии BALB/c были использованы как универсальный стандартный индуктор половой мотивации, ранее использованный в наших экспериментах при тестировании мышей разных генотипов. Эструс вызывали введением за 24 ч до опыта 10 ЕД хорионического гонадотропина (профази, «Сероно», Италия). Наличие эструса у самок контролировали по вагинальному мазку. Мотивационное поведение изучали только у самцов группы, самка которым предъявлялась на 60 мин, регистрируя каждые 10 мин число подходов к разделяющей животных перегородке и время пребывания самца у перегородки [7]. В данном случае в день эксперимента клетку с животными переносили в соседнюю экспериментальную комнату, где после 5-минутной адаптации к условиям теста в течение 1 ч каждые 10 мин регистрировали время активного исследования самцом перегородки и количество подходов к ней. Тестирование поведения проводили с 16 до 18 ч. Число животных в группах составляло 9–10 особей.

Соблюдались все условия работы с животными в соответствии с международными нормами (Council of the European Communities Directive 86/609/EES).

Статистический анализ результатов проводили с помощью дисперсионного анализа с использованием пакета компьютерных программ Statistica (версия 6.0) с post-hoc сравнением групповых средних (Newman–Keul test). Различия считали достоверными при р<0,05. Значения поведенческих и гормональных параметров представлены как средняя арифметическая и ее ошибка (M±SEM).

Результаты и обсуждение

В настоящей работе установлено, что появление самки мыши в условиях, не допускающих непосредственного тактильного контакта, вызывает характерное поведение самца линии C57BL/6J, проявляющееся в желании находиться у разделяющей перегородки в попытках проникнуть через нее. Это согласуется с ранее полученными на других линиях лабораторных мышей данными [1, 7]. В результате 60-минутного теста выявлен эффект длительности пребывания рецептивной самки за перегородкой на время, проводимое самцом C57BL/6J у разделяющей животных перегородки (F_5,54=3,79; p<0,01), а также на количество подходов к ней (F_5,54=2,79; p<0,05; рис. 1). Проведенное post-hoc сравнение групповых средних значений показало достоверное снижение времени пребывания у перегородки у самцов к концу исследования (p<0,05 – после 50-й минуты; p<0,01 – после 60-й минуты экспозиции самки; табл. 1, 2; см. рис. 1). Эти результаты отличаются от подобного ранее проведенного исследования поведения самцов других линий – СВА/Lac и A/He, где показано наличие характерного поведения самца на протяжении всего периода тестирования, когда даже на 60-й минуте, несколько снижаясь, достоверно не отличалось от любой другой временнóй точки [6, 7].

Таким образом, настоящее исследование продемонстрировало отличающийся паттерн поведения самцов мышей линии C57BL/6J у перегородки по сравнению с самцами мышей линий СВА/Lac и А/Не. Что касается другого, в большей степени связанного с двигательной активностью показателя поведения самца у перегородки – числа подходов к ней, то у мышей C57BL/6J он зависел от времени пребывания самки за перегородкой (F_5,54=2,79; p<0,05). На 30-й, 40-й и 50-й минутах тестирования значения этого параметра были ниже, чем в начальных и конечной точках, однако достоверных различий по выраженности данного показателя в отдельные временные точки post-hoc-анализ не показал (см. рис. 1).

Определение содержания тестостерона в периферической крови самцов C57BL/6J выявило отчетливое его повышение, вызванное появлением за перегородкой самки (рис. 2). Дисперсионный анализ показал влияние фактора длительности пребывания рецептивной самки за перегородкой на уровень гормона у самцов C57BL/6J (F_6,59=3,69; p<0,01). Через 30 мин после помещения самки концентрация тестостерона в крови самцов выросла в 3 раза по сравнению с базальным уровнем, после чего отмечено постепенное снижение содержания гормона до исходных значений.

Среди причин, которые могли бы объяснить отсутствие повышения уровня тестостерона у мышей исследуемой линии в предыдущих работах, можно выделить следующие:

• межлинейные различия в несоответствии по времени наступления выраженного гормонального ответа у самцов разных генотипов;
• влияние самой процедуры тестирования;
• влияние сезонных факторов.

Так, в работе [5] уровень тестостерона в крови самцов различных линий определяли через 40 мин, однако согласно результатам настоящего исследования, в это время у самцов C57BL/6J уже нет достоверной разницы в уровне гормона по сравнению с его значениями на 10-й или 20-й минутах. В работе [1] содержание тестостерона определяли, как и в данном исследовании, после 30-минутного пребывания с самкой, однако схема эксперимента была иной. В этой работе каждую клетку с самцом снимали со стеллажа, переносили в комнату для тестирования, открывали крышку, накрывали прозрачным оргстеклом и после 5-минутной адаптации самца к новым условиям в последующие 30 мин регистрировали его поведение у перегородки, за которую помещали рецептивную самку и уже после этого забиралась кровь для определения в ней тестостерона [1]. Вероятно, что в этих условиях тестирования помимо активации ГГСК происходила активация и гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы самцов, которая, в зависимости от генотипа, по-разному модифицировала у животных возникающий при этом эндокринный ответ семенников.

В природных условиях процесс размножения у мышевидных грызунов носит ярковыраженный сезонный характер. В проведенном нами ранее исследовании на мышах линии СВА/Lac показано, что для каждого сезона свойственна своя динамика уровня тестостерона в ответ на половую стимуляцию [7]. Так, в зимний период активация ГГСК у самцов СВА/Lac отмечена после 20-минутного пребывания их с самкой, тогда как летом подъем происходил после 40 мин.

Полученные данные позволяют поставить ряд актуальных вопросов по конкретным механизмам половой активации самцов линии С57BL/6J при условии отсутствия тактильного контакта с самкой.

Хорошо известно, что для самцов данной линии характерен относительно низкий уровень базального тестостерона [2] на фоне резкого снижения чувствительности к изовалериановой кислоте – ключевого компонента вагинальных выделений мыши [4, 13, 22]. Неясно и относительное значение феромональной стимуляции в данных экспериментальных условиях мультисенсорной стимуляции ГГСК у животных данной линии. В настоящее время общепринято, что кодирование обонятельного образа у мышей и крыс тесно связано с феноменом физиологической протеинурии – резко повышенным выделением с мочой низкомолекулярных белков – липокалинов, кодируемых у мышей комплексом генов Mup (Chr. 4) [3, 9–11, 15]. Строго определенная комбинация этих белков наряду с рядом высоколетучих соединений (лигандов) составляют так называемый обонятельный код, позволяющий реципиенту судить о возрасте, генотипе и половой принадлежности донора. В расшифровке данной комбинации летучих компонентов мочи участвует как основная, так и дополнительная (вомероназальная) обонятельные системы реципиента [14, 21].

В свете полученных в настоящей работе результатов особый интерес представляют данные по роли хемокоммуникационных механизмов в формировании и поддержании так называемой Европейской гибридной зоны между ареалами обитания M.m. musculus и M.m. domesticus [16,19].

В целом конкретные нейрофизиологические половой активации у самцов линии С57BL/6, продемонстрированные в настоящей работе, нуждаются в дальнейшем изучении.

Заключение

Таким образом, в настоящей работе было показано, что при половом возбуждении у самцов C57BL/6J происходит активация ГГСК, а сам подъем уровня тестостерона, обусловленный присутствием рецептивной самки, – достаточно надежный параметр, характеризующий половое возбуждение самца. Тем не менее в эксперименте необходимо учитывать возможность различающегося времени наступления рефлекторного гормонального ответа семенников мышей в ответ на сексуальный стимул, который зависит от генотипа самца, дизайна эксперимента, а также от сезона, в который проводится исследование.

В работе использована генетическая линия мышей, входящая в состав уникальной̆ научной̆ установки (УНУ) «Биологическая коллекция – генетические биомодели нейропсихических заболеваний» (№493387) НИИФФМ.